陈喆 张青 钱定良 苏海珍 李向阳

肠球菌为革兰阳性球菌，广泛分布于人和动物消化道及女性生殖道内，是重要的条件致病菌，多见于医院感染。由于其固有耐药和获得性耐药的双重特性，以及各类抗生素广泛应用造成的高选择性压力，导致多重耐药（multiple drug resistance，MDR）肠球菌逐渐增多，甚至出现耐万古霉素肠球菌（vancomycin-resistantenterococci，VRE）。利奈唑胺是一种人工合成的吧恶唑烷酮类抗菌药物，通过与细菌核糖体50S亚基结合抑制转录的初

始步骤起抑菌作用，对革兰阳性菌，包括耐青霉素的肺炎链球菌、耐甲氧西林的葡萄球菌和耐万古霉素的肠球菌均有良好的抗菌作用。随着利奈唑胺在临床上的使用，陆续出现了耐药菌株的报道[1-3]，根据近年卫生部全国细菌耐药监测网的监测报告显示临床上最常分离的耐药细菌为肠球菌。已知耐利奈唑胺肠球菌的耐药机制包括23S rRNA基因V区以及编码核糖体蛋白L3、L4的基因突变和由携带多重耐药基因cfr介导耐药，近年又发现新型耐药基因optrA。本文对近年临床分离的4株利奈唑胺低水平耐药粪肠球菌的耐药机制及其同源性进行探讨，现将结果报道如下。

1 材料和方法

1.1 菌株来源 收集 2016年1月至 2017年12月温州医科大学附属第三医院临床分离非重复肠球菌感染标本1 170份（粪肠球菌568株，屎肠球菌538株，其他肠球菌64株），全部菌株经Vitek 2 Compact全自动细菌鉴定系统配套的鉴定卡（GP）和药物敏感试验卡（GP-68）行菌株鉴定及体外药物敏感性试验。分离出耐药菌株4株（E01-E04），均为粪肠球菌，采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪（MALDI-TOF-MS）再次鉴定，并采用微量肉汤稀释法确认利奈唑胺最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）值。质控菌株为粪肠球菌ATCC29212，cfr基因阳性对照菌株为本实验室头状葡萄球菌，体外药物敏感性试验结果根据2017年美国临床实验室标准化协会（the clinical and laboratory standards institute，CLSI）标准判读。利奈唑胺的判读标准为：敏感（S）为 MIC≤2μg/ml，中介（I）为 MIC=4μg/ml，耐药（R）为 MIC≥8μg/ml。4株菌株标本类型分别为脓液、创面、尿液、腹水；分别来自普外科、烧伤修复科、泌尿外科和妇科。

1.2 主要试剂及仪器 Vetik 2 Compact全自动微生物分析系统、GP鉴定卡、GP-68药敏鉴定卡、MALDITOF-MS质谱仪（法国bioMerieux公司）；LB液体培养、哥伦比亚血琼脂平板（英国Oxoid公司）；细菌基因组DNA提取试剂盒（北京天根生化科技有限公司）；PCR扩增试剂、DNA Marker（DL2000）（上海生工生物工程公司）；PCR扩增仪、水平电泳槽、凝胶成像系统（美国Bio-Rad公司）；50*TAE缓冲液、琼脂糖粉末、gold view核酸染料（上海赛百威基因技术有限公司）。

1.3 细菌基因组提取 将冷冻干燥保存的肠球菌复苏并接种至哥伦比亚血琼脂平板，35℃培养24h后，再将肠球菌接种LB液体培养基进行过夜增菌，12～16h后根据北京天根生化科技有限公司细菌基因组DNA提取试剂盒说明书操作，提取粪肠球菌基因组DNA模板。

1.4 PCR扩增 23S rRNA V区基因、核糖体蛋白L3和L4编码基因（rplC、rplD）及多重耐药基因cfr和optrA的引物由上海生工生物工程公司合成，具体引物序列见表1。PCR 体系为：DNA 模板 2μl，上、下游引物各 1μl，PCR Mix（2*）25μl，加灭菌双蒸水至 50μl。

表1 PCR引物序列

取5μl PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳后在凝胶成像系统观察，剩余阳性扩增产物送上海生工生物工程公司双向测序拼接，测序合格的结果通过NCBI GeneBank（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov）与野生菌株数据库进行序列比对分析，确定粪肠球菌23S rRNA V区基因、L3和L4编码基因是否存在突变位点及是否存在cfr和optrA耐药基因。

1.5 多位点序列分型MLST 粪肠球菌MLST的7个管家基因（gdh、gyd、pstS、gki、aroE、xpt、yiql）引物序列和扩增条件参照粪肠球菌数据库（http://efaecalis.mlst.net/misc/info.asp）设计，由上海生工生物工程公司合成引物。反应体系同前。PCR扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳后送上海生工生物工程公司测序，使用BioEdit软件（Version7.0.9.1）处理测序结果，最后将测序结果录入PubMLST比对，从而确定其ST型。将本研究获得的等位基因序列数据使用eBURST软件（Version 3，http://eburst.mlst.net/）进行亲缘关系分析。

2 结果

2.1 药敏结果 4株粪肠球菌均表现为MDR，即对超过3种或3种以上抗菌药物耐药，对呋喃妥因、万古霉素及替加环素均敏感，而对四环素、喹奴普汀/达福普汀、利奈唑胺均耐药。微量肉汤稀释法检测法显示4株对利奈唑胺的MIC均为8μg/ml，呈低水平耐药。

2.2 突变位点及多重耐药基因cfr和optrA的PCR测序结果 4株粪肠球菌的23S rRNA V区基因、核糖体蛋白L3和L4编码基因均未发现任何位点突变（比对野生菌株GenBank CP033787），均未扩增出cfr基因，但optrA基因均扩增出阳性产物，且条带大小与目的基因相符，经测序比对4株均携带optrA基因，见图1。本研究进一步扩增同期分离且对利奈唑胺敏感的10株粪肠球菌和标准株（ATCC 29212）是否携带多重耐药基因cfr和optrA。结果显示，10株临床分离的利奈唑胺敏感粪肠球菌和标准株（ATCC29212）均未携带cfr和optrA基因。

图1 4株利奈唑胺低水平耐药粪肠球菌optrA基因电泳图（Marker：DL2000 Marker；N：阴性对照；E01-E04：4 株利奈唑胺低水平耐药粪肠球菌）

2.3 MLST分析 4株利奈唑胺低水平耐药粪肠球菌属于 4个 ST 型，分别为 ST476、ST16、ST116、ST75。4株菌株再与MLST数据库中972株粪肠球菌比较，发现第二大克隆群是ST16克隆复合体。本实验1株ST16、1株ST116和1株ST75属于3个不同的ST克隆群，而1株ST476为单独的ST型，见图2。

图2 MLST数据库中972株粪肠球菌的种群快照图

3 讨论

本研究共分离鉴定出肠球菌1 170株，其中利奈唑胺耐药肠球菌4株，均为粪肠球菌。粪肠球菌和屎肠球菌对利奈唑胺的耐药率分别为0.7%和0.0%，稍低于卫生部全国细菌耐药监测网的监测报告（粪肠球菌和屎肠球菌对利奈唑胺的耐药率为1.2%和0.2%）。

肠球菌对利奈唑胺的主要耐药机制可以分为两大类：非转移性耐药（23S rRNA V区突变和核糖体蛋白L3、L4突变）和转移性耐药（多重耐药基因cfr和新型耐药基因optrA）。利奈唑胺是通过结合核糖体肽基转移酶活性中心（peptidyl transferase center，PTC）的 A 位点发挥作用。A位点位于核糖体催化功能核心23S rRNA的V区，由此23S rRNA V区突变是目前已知最主要的耐药机制，最常见的突变位点为G2576T[6]。核糖体蛋白L3大部分位于核糖体50S亚基的表面，有一个环状的尾部延伸至肽基转运中心（PTC），L3的点突变（如F147L和A157R）可导致利奈唑胺MIC值的上升。核糖体蛋白L4也位于与PTC距离很近的区域。cfr基因编码一种甲基转移酶，这种酶能够修饰细菌23S rRNA（在A2503的位置，导致转录后的甲基化）并且导致对多种抗菌药物（如利胆醇、林肯酰胺、吧恶唑烷酮类、链酶杀阳菌素A）产生耐药。cfr基因大多以质粒作为载体，2004—2012年的全球多中心监测研究 ZAAPS显示该耐药机制在利奈唑胺耐药肠球菌中很少见[8]，多见于利奈唑胺耐药葡萄球菌。本研究对上述耐药机制进行了初步研究，均未检测到23S rRNA V区、核糖体蛋白L3和L4编码基因任何位点突变，cfr基因也显示为阴性，因此初步推断4株利奈唑胺低水平耐药与新发现的optrA基因有关。

optrA基因于2015年由Wang等[7]首次在中国动物源和人源分离的肠球菌中发现，该基因既可以存在于染色体上，也可存在于质粒上，是继cfr之后报道的第2个可转移性耐药基因。其编码一种ABC转运蛋白，属于ABC家族，该家族是细菌中存在的一种外排装置，可介导肠球菌对吧恶唑烷酮类和利胆醇类抗生素的耐药性，还可以介导金黄色葡萄球菌对氯霉素类的耐药性[7]。有研究显示76.5%optrA基因阳性菌株对利奈唑胺非敏感，MIC为4～8μg/ml，大多数optrA基因阳性菌的cfr基因检测结果为阴性[9-11]。本文显示4株利奈唑胺低水平耐药粪肠球菌均携带optrA基因，MIC为8μg/ml，且cfr基因阴性，与研究相符。在中国的21个省市29家医院监测到2004—2014年optrA基因阳性的肠球菌已经从0.4%上升到3.9%，且在粪肠球菌中比屎肠球菌中常见（3.7%vs0.5%）[12]。本研究的4株optrA阳性利奈唑胺耐药粪肠球菌为浙江瑞安地区首次报道。除外中国，在美国、意大利也发现了携带optrA基因的肠球菌[13-14]。

根据MLST分型结果和菌株分离科室等相关信息，推测利奈唑胺耐药粪肠球菌菌株在本院呈散发，本院发现的 4 个 ST 型，分别为 ST476、ST16、ST116、ST75，其中ST16型和ST476型亦有报道见于浙江、广东和河南的医院[10]。

综上所述，本研究初步推断携带optrA基因与粪肠球菌对利奈唑胺呈现低水平耐药有关，可进一步研究optrA基因的定位和遗传背景，该基因的出现已经引起了国内外相关学者的关注，因此应做好利奈唑胺耐药菌的相关实验室检测和流行病学监测，防止该类菌在医院环境中的播散和流行。