王瑾 杨毅 盛泳佳 李文燕 韩晨阳

近几年来研究表明，肿瘤为了逃避代谢压力，发生了转移，这个过程需要能量支持，同时伴随着物质代谢[1-3]。正常细胞的能量代谢以有氧糖代谢为主，而肿瘤细胞以无氧糖酵解的代谢方式为主，这种代谢方式可以使得肿瘤获得更高的侵袭能力，逃避正常的细胞凋亡程序。正常细胞中糖类代谢的主要方式是有氧代谢，在缺氧条件下则发生糖酵解，产生乳酸[4-5]。研究证实，肿瘤细胞即使在有氧环境中依然进行无氧糖酵解，而不经过线粒体的氧化磷酸化过程[6]，因此调控肿瘤物质能量代谢成了肿瘤治疗新的方向。

微小 RNA-122（microRNA，miRNA）是一种＜20nt的非编码RNA，可以结合到mRNA编码区，影响蛋白质合成，在细胞生理和病理过程中发挥着重要的调控作用。乳腺癌存在多种miRNA的异常表达，其中miRNA-122在乳腺癌中呈低表达。研究表明，miRNA-122在乳腺癌中的表达水平直接影响到肿瘤患者的预后，但是miRNA-122低表达的调控原因不明，其作用机制也尚未明确[7-8]。课题组前期研究发现，miRNA-122是M型丙酮酸激酶（pyruvate kinase M，PKM）和柠檬酸合酶（citrate synthase，CS）的调控非编码RNA。PKM和CS是糖代谢的关键酶，其表达水平可以影响糖酵解过程，尤其是PKM表达增高可以促进肿瘤细胞对于葡萄糖的摄取和利用，提高其代谢水平。本研究拟以人乳腺癌细胞为对象，从能量代谢的角度探讨miRNA-122抑制乳腺癌细胞增殖、侵袭的作用机制。

1 材料和方法

1.1 细胞和试剂 人乳腺癌细胞株MCF-7、DMEM高糖培养基购于武汉普诺赛生命科技有限公司（批号：CL-0149、158758）。miRNA-122 mimic 购于德国 QiAGEN公司（批号：Q1854241）；cDNA试剂盒购于凯基生物技术有限公司（批号：KGA1311）；实时定量PCR试剂盒/SYBR Green Real time PCR Master Mix购于Sinobio公司（批号：E090）；总 RNA 提取试剂盒（Trizol法）购于BioTeKe公司（批号：RP2041）；双荧光素酶检测试剂盒、T4 DNA连接酶和感受态大肠杆菌DH5α购于Promega公司（批号：A18243654、M1794185、D1814522）；Opti-MEM无血清培养基购于Gibco公司（批号：15685）；CCK-8检测试剂盒购于碧云天生物技术有限公司（批号：C0037）；PKM和CS单克隆抗体购于Cell signaling technology公司（批号：3827、14309）；GOD-POD 法葡萄糖检测试剂盒、乳酸检测试剂盒（乳酸脱氢酶法）购于北京雷根生物技术有限公司（批号：TC0711、TC0731）。

1.2 方法

1.2.1 荧光素酶报告基因验证miRNA-122和PKM、CS的调控关系 设计野生型PKM的3′非翻译区（untranslated region，UTR）片段，序列为 3′-CUGUCCUHCAGCAAACACUCCA-5′，突变型序列为 3′-CUGUCCUGCAGCAACCUCACAC-5′。野生型CS的3′UTR片段序列为3′-GAAAGGAUUAAGAUACAACUCCU-5'，突变型序列为3'-GAAAGGAUUAAGAUCUACGACU-5′。序列设计合成由吉玛生物公司完成，并进行质粒的构建，试验所用的质粒为实验室原有。PCR扩增条件为：反应体系50μl，95℃预热 4min，95℃变性 30s，55℃退火 30s，72℃延伸 90s，5 个循环；95℃变性 30s，60℃退火 30s，72℃延伸90s，25个循环；72℃延伸10min，4℃保存。将切胶回收的产物和载体酶切，T4 DNA连接酶线性化后与CD163 3′UTR片段连接，取连接产物转化至感受态大肠杆菌DH5α筛选阳性克隆。将miRNA-122转染后，PBS洗涤1次，加入裂解缓冲液后剧烈震荡15min，然后移入1.5ml离心管，10 000r/min 离心 1min 后，取上清液 20μl加入96孔板，采用多功能酶标仪检测荧光素酶活性。

1.2.2 细胞分组及 miRNA-122 类似物（mimic）转染MCF-7细胞体外采用DMEM高糖培养基培养，待细胞长至对数期后消化，将细胞分为Con组和miRNA-122组，Con组为未行miRNA-122转染的细胞；miRNA-122组进行mimic的转染。将mimic加入用DEPC处理的双蒸水，稀释浓度为100nmol/μl，将细胞接种至培养皿中，调节细胞浓度为7×105/ml，每孔体积1ml。细胞贴壁后进行转染，500μl的 opti-MEM 培养基中加入 20μl的mimic溶液，将细胞培养基更换成混合了mimic的无血清DMEM培养基。转染后12h弃去培养基，更换成DMEM完全培养基过夜培养。

1.2.3 流式细胞术检测细胞周期 Con组和miRNA-122组细胞接种在6孔板中贴壁培养24h，之后弃去培养基，加入500μl胰蛋白酶消化细胞，以PBS洗涤2～3次后，3 000r/min离心10min，收集细胞，加入 PI染液50μl，避光染色15min，洗去染液后上机检测。

1.2.4 CCK-8法检测细胞增殖能力 将Con组和miRNA-122组细胞接种到96孔板中，设置3组平行对照，待细胞贴壁后继续培养6、12、24、48h后检测细胞活力。弃去每孔的培养基后加入新鲜培养基100μl，同时加入10μl的CCK-8溶液继续孵育4h。轻轻摇匀培养板后，在450nm处检测OD值，同时设置空白培养基为空白对照。细胞增殖能力（%）=（OD实验组-OD空白对照）/OD空白对照×100%。

1.2.5 克隆形成实验 收集Con组和miRNA-122组细胞，调整细胞浓度为500～1 000个/孔，接种到6孔板中，每组设置3个复孔，同时采用含有30%FBS的DMEM培养基培养，每隔3d观察细胞状态。待细胞形成克隆后（2周时间），弃去培养基，PBS清洗2次后加入多聚甲醛固定，每孔加入结晶紫染色液1ml，摇匀后染色2min，弃去染色液后双蒸水洗2～3次，拍照后计算克隆形成数。

1.2.6 Transwell小室实验检测细胞侵袭能力 Con组

1.3 统计学处理 采用SPSS 17.0统计软件。计量资料以表示，多组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 荧光素酶报告基因验证 miRNA-122与 CS及PKM的靶向关系 空载体转染后，对荧光素酶活性无影响。miRNA-122转染后，miRNA-122组细胞中野生型 PKM 荧光素酶活性为（4.52±0.85），突变型 PKM 荧光素酶活性为（8.35±0.95），突变型 PKM 荧光素酶活性明显高于野生型，差异均有统计学意义（均P＜0.05)；miRNA-122组细胞中野生型CS荧光素酶活性为（3.57±0.35），突变型 CS 荧光素酶活性为（8.75±0.67），突变型CS荧光素酶活性明显高于野生型，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。Con组细胞中野生型PKM荧光素酶活性为（8.13±0.87），突变型 PKM 荧光素酶活性为（8.39±0.65），差异无统计学意义（P ＞0.05）；野生型 CS 的荧光素酶活性为（8.05±0.74），突变型 CS 荧光素酶活性为（8.32±2.35），差异无统计学意义（P ＞0.05），见图 1。和miRNA-122组细胞加入Transwell小室，待细胞贴壁后，上室用无血清的DMEM培养基培养，下室加入10%FBS的DMEM完全培养基培养，培养24h后取出小室，弃去培养基，甲醇固定后用0.1%的结晶紫染色，棉签擦去上层未迁移的细胞后，镜下计算迁移的细胞数。

1.2.7 Western blot检测糖代谢关键酶 HK、PKM、CS 的表达水平 Con组和miRNA-122组细胞培养48h后，弃去培养基，收集细胞，PBS洗涤2次，加入RIPA蛋白裂解液冰上裂解细胞30min，离心后取上清液，BCA试剂盒测定蛋白浓度，经过SDS-PAGE凝胶电泳，PVDF转膜、脱脂奶粉封闭，加入一抗孵育过夜后以TBST漂洗，加入IgG-HRP二抗孵育，ECL显色液显色后，成像系统成像，条带采用凝胶定量分析软件Quantity One 4.4处理后，以GAPDH为内参校正。

1.2.8 葡萄糖消耗量及乳酸水平的检测 细胞培养前，按照说明书操作检测MCF-7培养基以及DMEM高糖培养基中葡萄糖浓度，结果以mmol/L为单位表示，换算后作为初始葡萄糖含量A（mmol）。将Con组和miRNA-122组细胞接种到6孔板后，设置3组平行孔，待细胞贴壁后继续培养48h后，参照说明书操作再次检测葡萄糖含量，结果为A1（mmol），细胞对于葡萄糖的消耗量（mmol/h）=（A-A1）/48h。乳酸水平的检测采用试剂盒进行，最终乳酸水平以mmol/L为单位表示。

图1 荧光素酶报告基因实验结果（与Con组比较，*P＜0.05）

2.2 两组细胞的细胞周期检测结果比较 miRNA-122组细胞中S期和G1/G0期细胞比例高于Con组，差异有统计学意义（P＜0.05），而G2期细胞比例与Con组比较无统计学差异（P＞0.05）。细胞周期检测提示，miRNA-122组中细胞周期阻滞在G0/G1期，见图2-3。

图2 流式细胞术检测细胞周期（a：Con组；b：miRNA-122组）

图3 两组细胞的细胞周期分布比较（与Con组比较，*P＜0.05）

2.3 两组细胞增殖能力比较 miRNA-122转染后6、12、24、48h，CCK-8 检测显示，miRNA-122 组细胞增殖能力显著低于Con组，差异有统计学意义（P＜0.05）。说明miRNA-122类似物可以抑制细胞的增殖，见图4。

2.4 两组细胞克隆实验结果形成比较 在克隆实验的2 周内，Con 组细胞形成的克隆数为（58.65±8.15）个，显著高于 miRNA-122 组的（19.35±3.58）个，差异有统计学意义（P＜0.05），见图 5（见插页）。

2.5 各组细胞侵袭能力比较 Con组和miRNA-122组细胞均具有侵袭能力，在同一条件下培养24h后，Con组侵袭细胞（112.55±19.32）个，而 miRNA-122 组为（65.85±19.36）个，两组比较差异有统计学意义（P＜0.05），见图6（见插页）。

图4 细胞增殖能力的检测结果（与Con组比较，*P＜0.05）

图5 克隆形成实验（A：Con组；B：miRNA-122组；结晶紫染色）

图6 细胞侵袭实验结果（a：Con组；b：miRNA-122组；结晶紫染色，×200）

2.6 各组细胞糖酵解关键酶HK、PKM、CS的蛋白表达比较 Con组细胞中糖酵解关键酶HK、PKM和CS的蛋白水平显著低于miRNA-122组，差异均有统计学意义（均P＜0.05），说明细胞糖酵解被抑制，见图7。

2.7 两组细胞葡萄糖利用率和乳酸水平比较 培养48h后，Con组中葡萄糖的消耗水平显著高于miRNA-122组，而乳酸的产生水平也显著高于miRNA-122组，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见图8。

图7 两组细胞糖酵解关键酶的表达比较（a：蛋白电泳条带图；b：蛋白相对表达量统计柱状图；与Con组比较，*P＜0.05）

图8 细胞葡萄糖利用率和乳酸水平（a：葡萄糖消耗水平；b：乳酸产生水平；与Con组比较，*P＜0.05）

3 讨论

肿瘤细胞的能量代谢不同于正常细胞，1930年Warburg就发现肿瘤细胞中糖代谢的主要方式是无氧糖酵解，这种代谢方式不依赖于环境，称为Warburg效应。相比有氧代谢，糖酵解能够消耗更多的葡萄糖，产生乳酸，有利于维持肿瘤微环境。研究发现，绝大多数实体肿瘤中都存在代谢异常，Warburg效应广泛存在[9-10]。肿瘤细胞葡萄糖有氧代谢减少后，丙酮酸脱氢酶激酶（pyruvate dehydrogenase kinase，PDK）、乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）等的高表达可以进一步促进糖酵解的发生，而糖酵解作为肿瘤糖代谢的主要方式，可以产生三磷酸腺苷（adenosine triphophate，ATP）提供能量，也可以维持肿瘤微环境的乳酸供给，从而提高了肿瘤细胞抗凋亡能力，也为延长肿瘤细胞生存期提供了物质和能量的保证[11-12]。乳腺癌是一种转移能力较高的恶性肿瘤，随着病情的发展，往往会发生骨转移、肺转移、脑转移等[13]，转移过程中需要大量的能量供给，所以乳腺癌细胞的代谢异常旺盛，这种代谢能力也和Warburg效应直接相关。

miRNA能结合到mRNA 3′UTR区，导致mRNA降解或翻译受阻，从而下调靶基因的表达。miRNA表达失调与肿瘤的发生、进展和转移等有着密切联系，外周血液循环中的miRNA可作为肿瘤诊断和预后的分子标志之一。miRNA可通过小囊泡作为载体（如：外泌体exosomes）分泌到细胞外微环境中。越来越多的证据表明，miRNA能够通过这些小囊泡被转运到邻近或远处的细胞中，参与细胞功能调节[14]。研究发现，miR-122能调节细胞胆固醇外流、肝脏甘油三酯含量及β氧化率，PKM是miR-122潜在的靶基因之一[15-16]。由于脂代谢和糖代谢密切相关，以往的研究已经证实miRNA-122与脂代谢的关系，而miRNA-122也是PKM的重要调控非编码RNA之一，因此在脂代谢和糖代谢中miRNA-122可能都有一定的作用，除了可以调节脂的代谢水平外，也可以降低糖代谢的水平[17]。研究已经发现，在乳腺癌细胞中miRNA-122低表达，而外周血中miRNA-122表达增高，这提示miRNA-122可能通过细胞外分泌的方式产生生物学效应，但是miRNA-122是否影响乳腺癌细胞糖代谢还需要进一步深入的研究[18-19]。

本研究采用荧光素酶报告基因法证实了miRNA-122是PKM和CS的调控基因，miRNA-122可以抑制PKM和CS翻译过程。而PKM和CS是糖酵解的关键酶，对于葡萄糖转化成乳酸的关键环节具有调控作用。后续实验中也发现，miRNA-122类似物转染后，糖酵解相关的酶活性受到抑制，葡萄糖利用率下降，乳酸水平也下降，这表明，miRNA-122抑制了细胞的Warburg效应，降低了乳酸的产生。同时细胞周期发生阻滞，细胞增殖率也下调，细胞克隆形成能力和侵袭能力也减弱，笔者认为这也是因为细胞能量供应不足所致[20]。综合上述实验结果，笔者得出结论，miRNA-122可以通过靶向抑制PKM和CS基因表达，抑制蛋白质的翻译，同时抑制了细胞Warburg效应，降低乳腺癌细胞转移侵袭的能力。

综上所述，本研究发现miRNA-122可以通过调节乳腺癌细胞Warburg效应，抑制乳腺癌细胞转移和侵袭，这是miRNA-122在肿瘤细胞内的作用，而在细胞外和细胞间信息传递和功能依旧需要进一步深入研究。