李树志 周军 赵月明 岳修臣 孙许林 赵鹏 刘杰 张鹏

自发性颅内出血（非创伤性脑出血和蛛网膜下腔出血），是一种严重的脑卒中，常常会导致超过50%的病例死亡或严重残疾，出血的主要形式包括高血压引起的脑出血（hypertensive intracranial hemorrhage HICH）、脑淀粉样血管病（cerebral amyloid angiopathy，CAA）相关脑出血（CAA-related hemorrhage，CAAH）[1]。

已有研究表明载脂蛋白E（apolipoprotein E，APOE）的基因多态性与CAAH的发生有关，但迄今的研究结果并不一致，仍存在争论。Greenberg等[2]发现，CAAH患者的ε4等位基因频率明显高于深部脑出血患者或正常非痴呆人群。然而，另外一些学者发现，ε2等位基因在CAAH患者中频率较高[3]。2014年发表的一项 Meta分析显示，ε4等位基因与CAAH发病有明显关联性，而ε2等位基因经统计学分析无明显相关性[4]。本研究通过比较分析137例患者APOE等位基因的频率，以进一步明确APOE等位基因和CAAH的相关性，现报道如下。

资料与方法

一、一般资料

选取高密市人民医院神经外科自2015年3月至2018年1月收治的87例脑出血患者为研究对象，其中术后病理支持的、可能与CAA相关的脑出血患者36例（CAAH组），同期原发性HICH患者51例（HICH组）。选取同期门诊非心脑血管疾病健康体检者50例为对照组。分组情况：（1）CAAH组：符合Greenberg等[2]制定的CAAH诊断标准。其中男性13例，女性 23例，年龄范围 56～97岁，年龄（72.3±5.9）岁；（2）HICH 组：符合 1995 年中国脑出血诊治指南[5]。其中男性20例，女性31例，年龄范围36～80岁，年龄（61.1±4.9）岁；（3）对照组：男性 19 例，女性31 例，年龄范围 35～78 岁，年龄（55.0±6.2）岁。3 组患者的性别、年龄比较差异无统计学意义（P＜0.05），具有可比性。所有研究对象均由患者或家属签署知情同意书。排除标准：外伤、肿瘤、药物、血液病所致的脑出血者；自发性蛛网膜下腔出血；静脉窦血栓、动静脉畸形；合并有肝肾、造血系统和内分泌系统等严重原发性疾病；合并阿尔茨海默病者。

二、方法

用低渗红细胞裂解法、白细胞沉降法、洗涤剂和蛋白酶K法从全血中提取基因组DNA[6]。通过PCR扩增已知引物序列的227 bp区（上游：5’TCCAAGG AGCTGGGCGGCG3’； 下游：5’ACGAATTCCCGCCG CCTGGGTACACTGCC3’），以鉴定APOE等位异构体。该区域位于该基因的第4外显子，其中包括密码子 112（核苷酸 3745）和 158（核苷酸 3883），并具有此多态性[7]。采用限制性内切酶CFOI切割扩增ε，聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，以鉴定APOEε3（Cys-112，Arg-158）、APOEε4 （Arg-112，Arg-158） 和APOEε2（Cys-112，Cys-158）。

等位基因频率采用平衡法：ε2=APOEε2/2+1/2（APOEε2/3+APOEε2/4）；ε3=APOEε3/3+1/2（APOEε2/3+APOEε3/4）；ε4=APOEε4/4+1/2（APOEε3/4+APOEε2/2）。

三、统计学分析

计算各组基因型频率及等位基因频率，符合Hardy-Weinberg遗传平衡法则，应用SPSS17.0软件进行统计学处理，各研究组之间APOE等位基因的类型和频率以率（%）表示，采用χ2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

各组之间的基因型频率见表1。3组研究结果显示，APOEε3/ε3 基因频率最高， 分别为 39%、45%、52%；含 ε3 的杂合子（APOEε3/ε4 和APOEε2/ε3）居中 ；APOEε2/ε2、APOEε4/ε4 和APOEε2/ε4 基 因 型频率最低。CAAH组患者ε2频率高于HICH组和对照组，差异具有统计学意义（P＜0.05）；3 组的 ε3、ε4等位基因差异无统计学意义（P＞0.05）（表 2）。在CAAH组中，有11例患者为多发脑叶出血，其ε2频率高于单发脑叶的患者，但差异无统计学意义（P＞0.05）（表 3）。

表1 载脂蛋白E基因型和等位基因在不同颅内出血组和对照组中的分布[例（%）]

表2 不同组别之间等位基因对比分析

表3 等位基因在单发和多发脑淀粉样血管病相关脑出血患者中的分布

讨 论

CAA的特点是淀粉样蛋白（最常见的是β样淀粉蛋白）沉积在脑内和软脑膜血管中，很长一段时间内，人们并不确定其临床意义。1909年，Oppenheim[8]首次说明阿尔茨海默病的病理改变与中枢神经系统中的血管淀粉样沉积有关。随后，Okazaki等[9]于1954年和1979年分别描述了CAA的临床和组织学特征，明确了CAA与脑出血存在密切关联。同时一些学者发现，随着年龄的增长，CAAH的风险不断增大，65～74岁为 2.3%，75～84岁为 8.0%，85岁以上者为12.1%[10]。

在病理学研究中，淀粉样蛋白在血管壁的沉积是CAA的显著特征。这种蛋白沉积可导致进行性血管病变，最常见的临床表现为CAAH，这也是CAA导致死亡的最常见原因[11]。CAA相关脑血管破裂的机制尚不清楚，但可能涉及血管壁的顺应性降低、破裂和弱化，导致局灶性壁碎裂和内膜损伤。这些过程可能导致微量血液外溢，导致亚临床点状出血（脑微出血），或有临床症状的脑叶出血[12]。

APOE是一种含有299个氨基酸的单链多态糖蛋白，是血浆脂蛋白的重要组成部分，参与其转运和代谢过程。APOE基因呈多态性改变，以ε2、ε3和ε4等位基因形式存在，可存在 6 种基因型（ε2/ε2、ε2/ε3、ε2/ε4、ε3/ε3、ε3/ε4 和 ε4/ε4），ε3 在人类群体中的基因频率最高，出现在1/2～2/3的人群中，因此ε2和ε4被称为突变型[13]。

流行病学研究表明，APOE基因是CAAH的主要危险遗传因素[14]。APOE基因多态性不仅对脑出血的发生风险有重要的预测作用，而且还与脑出血的严重程度有关。Biffi等[15]研究发现ε2可能与血管改变有关，在影响脑叶出血的严重程度和临床进程中起着重要作用，可增加患者预后不良和死亡的几率，但与深部脑出血之间没有明确关联。O’Donnell等[16]研究发现APOE等位基因型为脑叶出血复发的危险因素。一些学者研究CAAH的数据显示，ε4等位基因频率与健康体检组及其他出血组之间差异无统计学意义[17]。

本研究结果表明APOEε2等位基因与CAAH有密切联系，而HICH组和对照组的APOEε2等位基因频率差异无统计学意义。目前还不清楚ε2参与CAAH的具体原理机制，可能与APOE和A肽相互作用并影响其聚集和清除能力有关，有学者曾指出，CAAH患者与CAA无出血患者之间的主要区别是出血患者中存在特定的 “CAA相关的血管病变”[18,19]。拥有ε2可能会导致淀粉样血管病变的发生，CAAH组和HICH组患者进行了APOE等位基因型的检测，结果显示，与ε4相比，ε2等位基因的存在使脑叶出血患者的血肿体积增大，增加血肿扩大的风险。在临床治疗中，含有ε2基因型的患者脑出血的复发性和死亡率均较高。

CAAH常常发生在年龄较大的群体中，ε2等位基因频率最高的群体（CAAH患者）也是年龄最大的群体（平均年龄72.3岁）[20]。这一观点与本研究结论相同。Cauley等[21]调查显示，在870例年龄为65～90岁的妇女中，ε2频率为8.4%，而473例42～50岁的妇女为5.9%，同时发现，在年龄较大的患者中ε4频率较低。

综上所述，APOE等位基因与CAAH有着强烈而特异的联系，这一关联可能揭示了淀粉样血管破裂的病理生理机制。CAAH的临床诊断仍然是一个挑战，尤其在神经影像学显示没有微出血的情况下，虽然目前APOE基因型的检测在CAA诊断中尚没有明确的作用，但其与CAAH的关系有许多潜在的临床意义，值得临床工作者重视。