张杰，唐桥斐

头颈部鳞状细胞癌（head and neck squamous cell carcinoma，HNSCC）是较为常见的恶性肿瘤，每年在全球可造成30多万人死亡，其发病率仍不断上升［1］。下咽鳞状细胞癌（hypopharyngeal squamous cell carcinoma，HSCC）是HNSCC 中致死率最高的一种，据报道5 年存活率仅为30%［2］。长链非编码RNA（LncRNA）是一类功能性非编码RNA分子［3］，可通过多种途径参与生物体的关键生理生化过程，包括多种癌症［4］。尿路上皮癌抗原1（urothelial carcinoma associated 1，UCA1）被证明是一种膀胱癌特异性lncRNA［5］，在肝细胞癌、肺癌、结肠直肠癌和胃癌中的表达呈上调趋势［6］，但目前关于lncRNA UCA1 在HSCC 中发挥的作用及机制的研究较少。因此，本研究将主要探讨lncRNA UCA1 对HSCC FaDu 细胞增殖、侵袭、凋亡及周期的影响，为HSCC诊断和治疗提供新的方向。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株 人咽鳞癌细胞系FaDu 购自于中乔新舟，细胞用含10%胎牛血清的MEM培养基于37 ℃，5%CO2的培养箱内常规培养。

1.1.2 主要试剂 MEM 培养基（Gibco，美国），胎牛血清（Hyclone，美国），脂质体2000（Invitrogen，美国），胰酶（碧云天，上海），UCA1 siRNA 及NC siRNA（UCA1 siRNA 序列为Sense 5' -GUUCACCAUUCCAGAAUAATT-3' ，Anti-Sense 5'-UUAUUCUGGAAUGGUGAACTT-3'；NC siRNA 序列为Sense 5' -UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3' ，Anti-Sense 5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3'；吉玛制药，上海），CCK-8（万类生物，沈阳），TRIpure、Super M-MLV 反转录酶、2×Power Taq PCR MasterMix、SYBR Green（BioTeke，北京），细胞周期检测试剂盒（碧云天，上海），Transwell 小室（Corning，美国），结晶紫（Amresco，美国），全蛋白提取试剂盒、BCA 蛋白浓度测定试剂盒以及Bax、Bcl-2、cleaved-Caspase 9、cyclin D1、PCNA抗体（万类生物，沈阳）。

1.2 方法

1.2.1 细胞转染 将FaDu细胞分为3组，Control组为未转染组，si-NC 组为转染NC siRNA 组，si-UCA1 组为转染UCA1 siRNA 组。未转染组不做转染实验，对si-NC 组及si-UCA1组的细胞进行如下操作：待细胞生长至70%融合时进行转染处理，将脂质体2000 和siRNA 试剂于室温混匀，然后将混合液加至细胞中于37 ℃、5%CO2培养4 h，然后更换为完全培养基，在37 ℃、5%CO2条件下继续培养，用于后续实验。

1.2.2 Real-time PCR 检测 收集转染siRNA后的3组细胞，根据TRIpure 试剂说明书提取细胞总RNA，使用紫外分光光度计NANO 2000 测定各样本中RNA 的浓度及纯度，然后将RNA 样品反转录得到cDNA，以cDNA 为模板扩增UCA1（引物序列上游：5'-CATTCAGACCGCCACTCA-3'；下游：5'-CCAGTTAGCGTATTTTTGAGC-3'）及β-actin（引物序列上游：5'- ACCCTGAAGTACCCCATCGA -3' ；下游：5' -CAAACATGATCTGGGT CATCT-3'）；反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，共40 个循环。所得数据利用2-ΔΔCt法进行分析。

1.2.3 CCK-8检测细胞增殖 将FaDu细胞接种于96孔培养板中，每孔的细胞个数为3×103个，每组设5 个复孔，37 ℃、5%CO2培养至细胞贴壁后进行细胞转染，将细胞于37 ℃，5%CO2培养箱中分别培养0、24、48、72、96、120 h 后，弃去上清，每孔加入100 μL 完全培养基及10 μL CCK-8，37 ℃、5%CO2培养1 h后，用酶标仪检测450 nm处光密度（OD）值。

1.2.4 Transwell检测细胞侵袭实验 用40 μL预先稀释好的Matrigel胶包被小室，然后将Transwell小室放入24孔板中，每组设5个复孔，向上室中加入1×105/孔的细胞，然后进行细胞转染，在37 ℃、5%CO2细胞培养箱中培养24、48 h。细胞培养结束后取出24孔板，将Transwell 小室用PBS清洗2次，4%多聚甲醛室温下固定20 min，0.5%结晶紫染液染色5 min，蒸馏水清洗后在倒置显微镜下（×200）对侵袭至微孔膜下层的细胞计数。

1.2.5 流式细胞术检测细胞周期 收集细胞后用70%乙醇在4 ℃下固定2 h，用碘化丙啶和RNase A 处理细胞，在37 ℃环境下避光温育30 min，随后进行流式检测。

1.2.6 Western blot实验 离心收集细胞，利用全蛋白提取试剂盒以及BCA 蛋白浓度测定试剂盒进行细胞总蛋白的提取和定量，蛋白样品调至等量（40 μg）后经SDS-PAGE 电泳分离，然后在80 V电压下湿转膜1.5 h，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，一抗（Bax 抗体、Bcl-2 抗体、cleaved-Caspase 9 抗体、cyclin D1 抗体、PCNA 抗体分别以1∶500 比例稀释）4 ℃孵育过夜，TBST 洗膜4 次，每次5 min，HRP 标记的二抗（1∶5 000 稀释）37 ℃孵育45 min，TBST 洗膜6 次，每次5 min，ECL 化学发光显影，凝胶成像系统分析处理。

1.3 统计学方法 采用SPSS 17.0 软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组之间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），组间多重比较用LSD-t法，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Real-time PCR 检测转染siRNA 后lncRNA UCA1 的表达水平 3 组间细胞的lncRNA UCA1 表达水平比较差异有统计学意义（n=3，F=742.76，P＜0.01），si-UCA1 组细胞的lncRNA UCA1 表达水平（0.25±0.02）较Control 组（1.00±0.02）、si-NC 组（0.92±0.04）显著下调，差异均有统计学意义（P＜0.05）。

2.2 下调lncRNA UCA1表达对FaDu细胞增殖的影响 CCK-8检测结果显示，除0 h各组OD 值差异无统计学意义外，各个时间点si-UCA1组的OD值均显著低于Control 组及si-NC 组（P＜0.05），Control 组及si-NC组间比较差异无统计学意义，见表1。

Tab.1 The effect of downregulation of lncRNA UCA1 expression on the proliferation of FaDu cells表1 下调lncRNA UCA1表达对FaDu细胞增殖的影响（n=5，OD值，±s）

Tab.1 The effect of downregulation of lncRNA UCA1 expression on the proliferation of FaDu cells表1 下调lncRNA UCA1表达对FaDu细胞增殖的影响（n=5，OD值，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；a 与Control 组比较，b 与si-NC 组比较，P＜0.05；表2～4同

组别Control组si-NC组si-UCA1组F 0 h 0.23±0.03 0.22±0.02 0.22±0.03 0.369 24 h 0.37±0.06 0.33±0.05 0.26±0.05ab 5.881＊48 h 0.55±0.06 0.58±0.06 0.38±0.04ab 18.861＊＊组别Control组si-NC组si-UCA1组F 72 h 0.62±0.06 0.64±0.06 0.45±0.06ab 13.317＊＊96 h 0.67±0.05 0.64±0.07 0.48±0.61ab 12.875＊＊120 h 0.68±0.07 0.67±0.07 0.51±0.06ab 10.256＊＊

2.3 下调lncRNA UCA1表达对FaDu细胞周期的影响 流式细胞术结果显示，与Control 组及si-NC 组比较，si-UCA1 组G1 期细胞比例显著增加，S 期和G2 期细胞比例显著下降，差异有统计学意义（P＜0.05），见图1、表2。

Fig.1 The effect of si-UCA1 on FaDu cell cycle detected by flow cytometry图1 流式细胞术检测si-UCA1对FaDu细胞周期的影响

Tab.2 The effect of downregulation of lncRNA UCA1 expression on the cell cycle of FaDu cells表2 下调lncRNA UCA1表达对FaDu细胞周期的影响（n=3，%，±s）

Tab.2 The effect of downregulation of lncRNA UCA1 expression on the cell cycle of FaDu cells表2 下调lncRNA UCA1表达对FaDu细胞周期的影响（n=3，%，±s）

组别Control组si-NC组si-UCA1组F G1 67.27±0.91 66.30±3.11 75.27±1.42ab 17.413＊＊S 13.64±0.85 13.83±0.67 7.68±0.76ab 63.185＊＊G2 16.53±0.47 16.27±0.48 14.30±0.55ab 17.791＊＊

2.4 下调lncRNA UCA1 表达对细胞凋亡、周期、增殖相关蛋白表达的影响 Western blot 结果显示，与Control 组及si-NC 组比较，si-UCA1 组细胞中Bax、cleaved-Caspase 9 蛋白水平显著升高，Bcl-2、cyclin D1、PCNA蛋白表达水平显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05），见图2、表3。

Fig.2 Western blot analysis of the effects of si-UCA1 on protein expression levels of Bax,Bcl-2,cleaved-Caspase 9,cyclin D1 and PCNA in FaDu cell line图2 Western blot检测si-UCA1对FaDu细胞系中Bax、Bcl-2、cleaved-Caspase 9、cyclin D1、PCNA蛋白表达水平的影响

2.5 下调lncRNA UCA1表达对FaDu细胞侵袭的影响 Transwell 侵袭实验结果显示，培养24 h 后的各组间侵袭细胞数量差异无统计学意义；培养48 h后，si-UCA1组侵袭细胞数量较Control组、si-NC组显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05），见图3、表4。

3 讨论

HSCC 是致死率极高的头颈部恶性肿瘤，由于HSCC早期症状不明显，大多患者在确诊时就已处于疾病晚期。目前对于HSCC的治疗手段多为手术治疗，但多预后不良［7］。因此，探索HSCC 发生发展的分子机制，尽早发现HSCC 特异性肿瘤标志物和治疗靶点，对HSCC的诊断、治疗及预后意义重大。

Tab.3 The effects of si-UCA1 on apoptosis,cell cycle and proliferation related protein expressions表3 si-UCA1对细胞凋亡、周期、增殖相关蛋白表达的影响（n=3，±s）

Tab.3 The effects of si-UCA1 on apoptosis,cell cycle and proliferation related protein expressions表3 si-UCA1对细胞凋亡、周期、增殖相关蛋白表达的影响（n=3，±s）

组别Control组si-NC组si-UCA1组F Bax 0.43±0.01 0.43±0.02 1.07±0.05ab 407.764＊＊Bcl-2 0.98±0.03 1.03±0.04 0.52±0.03ab 230.117＊＊组别Control组si-NC组si-UCA1组F cleaved-Caspase 9 0.48±0.04 0.51±0.04 1.01±0.02ab 237.640＊＊cyclin D1 0.54±0.07 0.45±0.03 0.25±0.02ab 34.329＊＊PCNA 0.59±0.07 0.61±0.04 0.32±0.07ab 21.545＊＊

Tab.4 The effect of downregulation of lncRNA UCA1 expression on the invasion of FaDu cells表4 下调lncRNA UCA1表达对FaDu细胞侵袭的影响（n=5，个/视野，±s）

Tab.4 The effect of downregulation of lncRNA UCA1 expression on the invasion of FaDu cells表4 下调lncRNA UCA1表达对FaDu细胞侵袭的影响（n=5，个/视野，±s）

组别Control组si-NC组si-UCA1组F 24 h 41.2±5.3 40.8±5.9 36.4±5.3 1.180 48 h 62.2±9.2 69.0±7.5 36.0±4.4ab 28.697＊＊

UCA1 是最先从膀胱癌细胞系BLZ-211 中克隆和鉴定的一种膀胱癌特异的lncRNA，被证实是膀胱肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭的重要调节者［5］。研究显示lncRNA UCA1 可能参与了多种癌症的疾病进展，例如Wang等［8］研究发现上调lncRNA UCA1可通过抑制miR-216b 和激活FGFR1/ERK 信号通路，进而促进肝细胞癌发生发展。本研究通过基因沉默技术抑制人咽鳞癌FuDa细胞中lncRNA UCA1的表达，然后观察细胞增殖、侵袭、凋亡和细胞周期分布的变化。细胞周期是一个高度有序的生物系统，调控着细胞的增殖分化，以往研究显示lncRNA UCA1可能参与了细胞周期调控。例如Huang 等［9］发现lncRNA UCA1 可通过抑制细胞周期负调控因子p27的表达促进乳腺肿瘤生长。在本研究中，抑制lncRNA UCA1 的表达可显著抑制细胞增殖能力，并诱导细胞大量阻滞于G1期，Western blot结果显示细胞周期和增殖相关蛋白cyclin D1、PCNA的表达水平显著下调。Wei等［10］也证明了lncRNA UCA1的缺失参与了黑色素瘤的细胞周期阻滞，与本研究结果一致。细胞凋亡紊乱会导致细胞异常增殖，是诱导癌症发生的重要机制，有研究认为lncRNA UCA1可通过抑制miR-184 的表达促进口腔鳞癌细胞凋亡［11］。本研究也证明了lncRNA UCA1 对人咽鳞癌细胞凋亡具有调控作用，在FuDa 细胞中下调UCA1 表达后，促凋亡相关蛋白Bax、cleaved-Caspase 9 表达水平升高，抑凋亡相关蛋白Bcl-2 表达下降，说明lncRNA UCA1 表达缺失可显著促进细胞凋亡发生。细胞侵袭是促使肿瘤转移的重要因素，本研究通过Transwell 实验证明了抑制lncRNA UCA1 可显著抑制人咽鳞癌细胞的侵袭能力，佐证了Gong等［12］认为lncRNA UCA1 参与了癌细胞转移的观点。除此之外，lncRNA UCA1 在胃癌、结肠直肠癌、肺癌等癌症中异常表达，并与癌症预后密切相关［13-14］，lncRNA UCA1 还被认为是急性心肌梗死的一个新的标志物［15］，提示其可能成为潜在标志物，为多种疾病的诊断及预后提供帮助。

Fig.3 Results of Transwell assay of the effect of si-UCA1 on invasion of FaDu cells（crystal violet，×200）图3 Transwell检测si-UCA1对FaDu细胞侵袭的影响（结晶紫染色，×200）

本次研究从细胞水平说明了下调lncRNA UCA1表达可以抑制FuDa 细胞增殖、侵袭并促进细胞凋亡，为lncRNA UCA1 调控HSCC 疾病进展提供了新的理论依据。但本次研究并未进行动物实验，无法确定在体内抑制lncRNA UCA1表达对HSCC的调控作用，故lncRNA UCA1 调控HSCC 发生发展的作用及机制仍有待于进一步探究。