王蕾，霍景瑞，张国安，贾力，田毅，杨晓晖，张晶晶，刘颖，吴楠，刘英富，3△

重链抗体是一种存在于骆驼体内的只有两条重链组成的抗体结构，其重链的可变区是抗原结合的关键区，在单独存在的情况下，同样具有抗原结合的能力，由于重链抗体的可变区分子直径小于100nm，并具备抗原结合能力，因此该结构又被称为纳米抗体［1］。抗体能够与抗原结合，发挥检测和拮抗抗原的功能，抗独特型抗体研究发现，抗体同样可以作为抗原刺激机体产生针对抗体的抗体［2-3］，抗体用作抗原进行免疫产生抗体反应，与抗体的可变区关系密切，纳米抗体作为小分子抗体，具有稳定性强、亲和力高、可溶性好等优势［4-5］，在疾病的诊断、检测等领域已得到广泛应用［6-9］，而纳米抗体作为抗原表位展示载体少有报道，本研究以β-人绒毛膜促性腺激素（β human chorionic gonadotropin，β-HCG）为研究靶蛋白，将β-HCG的C端短序列构建到纳米抗体可变区的CDR3 区，评估纳米抗体进行表位展示的方法在抗体制备中的应用价值。

1 材料与方法

1.1 材料 大肠杆菌BL21（DE3）、PET24a 表达载体为本实验室保存，引物、展示β-HCG C 端表位（氨基序列151～165）的纳米抗体基因（Nb-HCGβe）由中美泰和生物技术（北京）有限公司合成；内切酶、胶回收试剂盒、DNA 连接酶、DL2000、蛋白Marker、大鼠抗兔二抗均购自北京康为世纪生物科技有限公司；非小细胞肺癌细胞株A549、Nb-HCGβe 偶联凝胶介质购自天津泰克迪恩生物科技有限公司；α-HCG、β 促黄体生成素（β Luteinizing hormone，β-LH）蛋白购自北京景达生物科技有限公司，β-HCG 由本实验室表达纯化。新西兰大耳白兔购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK（京）2014-0004；免疫佐剂购自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 β-HCG 表位选择与Nb-HCGβe 基因合成 纳米抗体为前期实验室采集羊驼外周血分离淋巴细胞，设计引物扩增并测序得到的多个纳米抗体序列中，随机抽取其中一个纳米抗体作为表位展示载体。选择β-HCG C 末端（氨基序列151～165）15 个氨基酸长度，通过基因合成的方式，插入到纳米抗体CDR3 区，合成含β-HCG C 端表位的纳米抗体（Nb-HCGβe）基因，合成的基因含EcoRⅠ、XhoⅠ两个酶切位点。

1.2.2 Nb-HCGβe 载体构建、表达、纯化 将合成的Nb-HCGβe 基因、原核表达载体pET24a 分别用内切酶进行双酶切，酶切产物分别胶回收，连接酶连接，连接产物转化BL21（DE3）宿主菌，挑单克隆菌液PCR 鉴定，将鉴定阳性的宿主菌进一步测序鉴定。测序正确的样品，37 ℃摇菌培养，OD600达到0.8时，加入0.1 mmol/L IPTG诱导4 h，诱导结束后，冰浴超声破碎大肠杆菌（超声条件：功率400 W，工作5 s，间隔5 s，时长3 min），超声后样品12 000 r/min 离心10 min，分别收集上清、沉淀，SDS-PAGE电泳观察超声后上清、沉淀蛋白表达情况，根据表达结果，大量制备Nb-HCGβe，His 标签金属螯合亲合层析填料进行纯化。

1.2.3 Nb-HCGβe 免疫及血清效价检测 月龄3 个月，体质量1.5 kg 的大耳白兔2 只，饲养1 周开始免疫，Nb-HCGβe 抗原600 μg/只，初次免疫，弗氏完全佐剂蛋白乳化，皮下多点注射，初次免疫之后第14、21、28、35天采用弗氏不完全佐剂蛋白乳化，腹腔注射免疫，最后1 次免疫结束1 周后，取血检测效价，效价达到1∶100 000以上，视为免疫成功。

1.2.4 Nb-HCGβe 多抗纯化及效价检测 采集免疫成功的兔外周血，离心收集上清并与结合缓冲液1∶1 混合，0.45 μm滤器过滤，上样过Nb-HCGβe 偶联介质，结合缓冲液冲洗柱至检测器基线，0.1 mol/L Glycine-HCl（pH=2.7）洗脱液洗脱，洗脱样品用1 mol/L Tris-HCl 缓冲液（pH=9.0）快速中和。纯化的抗体SDS-PAGE 蛋白电泳，检测抗体的纯化效果，酶联免疫吸附测定（ELISA）法进一步检测纯化抗体的效价，以未免疫的兔多抗作为对照。

1.2.5 Nb-HCGβe 多抗Western blot 特异性检测 检测样品含Nb-HCGβe、β-HCG、A549细胞裂解液、α-HCG、β-LH、不含HCG 表位的纳米抗体做对照（Nb-C），SDS-PAGE 蛋白电泳，电泳结束后，电转PVDF 膜，5%脱脂奶粉封闭1 h，Nb-HCGβe偶联介质纯化的抗体作为一抗（1∶10 000稀释），4 ℃孵育过夜，PBST 洗涤3 次，二抗（1∶10 000 稀释）37 ℃孵育1 h，PBST洗涤3次，加入发光液检测，未免疫血清为对照。

2 结果

2.1 Nb-HCGβe 载体构建及鉴定 通过基因合成的方式，将β-HCG C 端序列插入到纳米抗体的CDR3区，合成的Nb-HCGβe双酶切后，连接pET24a原核表达载体并转化BL21（DE3）宿主菌，挑取4 个生长菌落进行菌液PCR鉴定，结果显示：4个菌落中1 个未见条带，3 个出现阳性条带，与预测大小一致（396 bp），见图1。3个阳性克隆中，随机挑取1个送检测序，测序结果正确。

图1 Nb-HCGβe 菌液PCR鉴定

2.2 Nb-HCGβe 表达、纯化 Nb-HCGβe 经原核表达和IPTG 诱导后，SDS-PAGE 蛋白电泳结果显示，Nb-HCGβe转化BL21（DE3）诱导后，在15 ku位置有目的条带表达，经超声破碎处理，表达的蛋白主要存在超声沉淀中，以包涵体的形式存在，见图2A。经包涵体洗涤，将8 mol/L 尿素裂解的蛋白进行His 标签纯化，经低浓度（5、10、20 mmol/L）咪唑去除杂蛋白，高浓度（100 mmol/L）咪唑洗脱获得目的蛋白纯度大于98%，见图2B。

2.3 Nb-HCGβe血清效价检测 纯化的Nb-HCGβe经复性处理后，免疫新西兰大耳白兔，免疫5 次后，第6 周耳缘静脉采集外周血，采用间接ELISA 法进行效价检测，2 只免疫后的兔血清效价均可达到1∶512 000，见图3。

Fig.2 Expression and purification of Nb-HCGβe图2 Nb-HCGβe的表达、纯化

Fig.3 Titer detection of Nb-HCGβe immune serum图3 Nb-HCGβe 免疫血清效价检测

2.4 Nb-HCGβe 免疫血清纯化及检测 免疫后的兔血清，抗原偶联介质纯化，得到抗Nb-HCGβe多抗（pAn-Nb-HCGβe），SDS-PAGE 电泳检测抗体纯化效果，能明显观察到重链、轻链两条带，见图4A，纯化后的抗体倍比稀释，抗体浓度约为0.02 mg/L 时，仍能够检测到阳性反应，见图4B。

2.5 Nb-HCGβe 多抗Western blot 鉴定 Western blot结果显示，pAn-Nb-HCGβe能够特异性结合Nb-HCGβe、β-HCG、A549 细胞裂解液中的β-HCG，与α-HCG、β-LH 未发生结合反应，见图5A，Nb-HCGβe 免疫血清可以检测到与Nb-C、Nb-HCGβe、β-HCG、A549 细胞裂解液4 个样品的阳性反应，同样未检测出α-HCG、β-LH，见图5B，对照血清与上述样品均未反应。

Fig.4 Purification and detection of antibody Nb-HCGβe图4 Nb-HCGβe抗体纯化及测定

Fig.5 Western blot specific detection of Nb-HCGβe antibody图5 Nb-HCGβe抗体免疫印迹特异性检测

3 讨论

抗体在疾病的诊断、治疗及基础研究方面发挥着日益重要的作用，抗体的制备研究对推动生命科学发展具有重要意义。在抗体制备过程中，抗原是抗体制备的基础，天然蛋白是抗体制备的理想抗原，然而由于天然蛋白往往存在着提取、表达、复性困难等各种各样的问题，以载体蛋白表位展示、噬菌体表位展示为代表的多种展示技术在抗原替代研究中得到广泛应用［10-11］。

匙孔血蓝蛋白（KLH）、鸡卵白蛋白（OVA）、牛血清白蛋白（BSA）是常用的展示载体［12-14］，但这些载体在表位展示时需要较复杂的表位偶联过程，为抗原的表位展示带来了不便。抗体作为抗原表位展示工具，在众多表位展示载体中具有较大优势，如抗体可变区本身就是多变的结构序列，其序列的变化不影响抗体结构的稳定性，具有较好的表位展示功能。抗体种类多样，包含传统重链、轻链组成的四链抗体、单链抗体、纳米抗体等类型，传统抗体、单链抗体都有相关抗原表位展示的研究报道［2-3］。而纳米抗体用来展示抗原表位少有报道，纳米抗体CDR3 区结构比传统抗体的相应区域要较长，弥补了轻链缺失造成的抗原结合力下降，同时较长的CDR3 区对抗体的免疫原性具有重要的贡献作用［4］，更加适合用于抗原表位的展示，同时纳米抗体分子质量小，产生的无关抗体相对较少，易于单克隆抗体的筛选，是较为理想的表位展示载体。

为验证纳米抗体CDR3 区表位的展示功能，本研究以β-HCG 为研究对象，进行其抗体的制备研究。HCG 分为a、β 两个亚单位，α 亚基与垂体分泌的β-LH、卵泡刺激素（FSH）、促甲状腺激素（TSH）结构基本相似，β-HCG与β-LH结构相近，其中游离β-HCG 的升高与乳腺癌、胃癌、肺癌等多种肿瘤发生密切相关［15-17］，是多种肿瘤的标志物，通过检测血液β-HCG的变化，可提高肿瘤诊断的准确性。

β-HCG与β-LH结构相近，但β-HCG羧基端最后24 个氨基酸延长部分在β-LH 中不存在，为提高检测的特异性，本研究选择β-HCG羧基端特异性结构序列，通过基因合成的方式，将β-HCG 羧基端序列插入到纳米抗体的CDR3 区进行原核表达，虽然纳米抗体具有较好的可溶性［18］，而本研究在进行表达时发现，构建的含β-HCG表位的纳米抗体在表达时主要是包涵体的形式，可能与表达载体有很大的关系。本研究选择的PET24a 表达系统有较强的原核表达能力，载体表达量大、表达速度快，可能是影响其可溶性的主要原因。虽然表达的Nb-HCGβe为包涵体，为了使β-HCG抗原表位能够以空间结构的形式存在，本研究对包涵体做了复性处理，由于纳米抗体具有较高的水溶性，易于复性，将复性的蛋白免疫动物，获得了针对Nb-HCGβe的多抗。

在对多抗的检测中，本研究选择了Nb-C、Nb-HCGβe、β-HCG、A549 细胞裂解液、α-HCG、β-LH进行了特异性检测。而在检测过程中需要注意，β-HCG 由165 个氨基酸组成，分子质量理论预测值为18.1 ku，而由于其高度的糖基化，其实际分子质量约为22.2 ku。Western blot 检测结果显示，Nb-HCGβe偶联介质纯化获得的多抗仅能够检测到Nb-HCGβe、β-HCG、A549细胞裂解液阳性反应，而未纯化的免疫血清不但能够检测上述3 种样品，还可以检测不含β-HCG 表位的Nb-C 对照纳米抗体，提示纳米抗体作为展示载体展示时，不但产生了针对CDR3区表位的抗体，同样产生了针对纳米抗体其他部位的抗体。

综上所述，本研究采用纳米抗体展示β-HCG抗原表位的方法，能够制备针对完整β-HCG 的抗体，在此基础上，今后将围绕单克隆抗体筛选及抗体标记技术，开展相关的研究，同时，由于自然界抗原种类多种多样、蛋白结构复杂多变，该方法能否适用其他蛋白，仍需要更多的实验去验证。