史一然 徐伟慧 吕智航

摘要：西瓜专化型尖孢镰刀菌（FON）是西瓜枯萎病的病原菌，生物防治是控制西瓜枯萎病的重要手段。研究解淀粉芽孢杆菌LZN01对FON的抑制效应。试验结果表明，解淀粉芽孢杆菌LZN01对FON的抑菌率为57.07%;FON孢子悬液与解淀粉芽孢杆菌LZN01发酵上清液按体积比1 ∶ 1混合培养6、12、24 h，孢子萌发抑制率分别为86.21%、67.50%、56.04%，抑制率随时间的增加呈下降趋势;经解淀粉芽孢杆菌LZN01发酵上清液处理，通过扫描电镜观察发现FON菌丝细胞膨大且畸变，菌丝表面严重受损;温度在-20 ℃～60 ℃之间，pH值在4～9之间，解淀粉芽孢杆菌LZN01的发酵液抑菌效果稳定;解淀粉芽孢杆菌LZN01发酵上清液抑菌能力稳定。综上所述，解淀粉芽孢杆菌LZN01对FON具有较好的抑制能力，且抑菌效果稳定，在西瓜枯萎病生物防治方面具有较大的开发和应用价值。

关键词：解淀粉芽孢杆菌;抑制作用;孢子萌发;发酵上清液;西瓜专化型尖孢镰刀菌;生防菌剂

中图分类号： S436.5  文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2019）12-0141-05

西瓜在世界园艺中占有重要比例，我国是西瓜生产和消费的第一大国，年种植面积为200萬hm2，年产量为7 000余万t[1]。西瓜枯萎病是由西瓜专化型尖孢镰刀菌（FON）引起的一种严重的世界性土传维管束病害，是导致西瓜产量和品质降低（含糖量下降）最重要的因素之一，该病轻则导致西瓜减产10%～40%，重则减产可达80%以上甚至绝收，是造成西瓜经济损失最大的病害之一[2]。随着西瓜种植面积的逐年扩大，连作重茬导致病原基数升高，更加重了西瓜枯萎病的发生。探究有效防治西瓜枯萎病的方法，已经成为当今西瓜生产上亟须解决的问题[3]。

近年来，针对西瓜枯萎病的防治，国内外学者已经做了大量研究。目前，我国培育的抗病品种主要有西农8号、京抗1号、秀丽等[4-6]，但由于西瓜遗传多样性极低，因此可被选育的抗病种质资源非常有限[7]，而且常规育种周期长，进度慢，技术难度系数高，所育出的抗病品种只是相对抗病，生命力不强，易受周围环境的影响[8]，无法从根本上解决问题;化学药剂对西瓜枯萎病的治理能够得到显著效果[9-11]，但其所产生的药物残留会造成环境污染，伤害非靶标生物，甚至破坏生态平衡，严重制约西瓜产业的绿色发展;利用葫芦、冬瓜等植物的根类进行嫁接栽培对防治西瓜枯萎病的治理有很好的效果并得到广泛应用[12]，但工作量大，会影响西瓜正常的生长发育及果实的口感，西瓜品质也会下降[2];物理手段防治西瓜枯萎病能够起到一定的防治效果[13]，但工作量较大。基于以上防治措施存在的问题，生物防治利用有益微生物或拮抗微生物抑制西瓜尖孢镰刀菌的生长，降低土壤中该病菌的数量，从而控制枯萎病病害的发生，是目前最有效且安全的防治手段[3]。因此，笔者所在实验室从西瓜根际筛选出一株FON的拮抗菌株解淀粉芽孢杆菌LZN01，研究其发酵上清液的稳定性和抑菌效应，旨在为后续生防菌剂的生产应用和贮存提供参考和理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试药品 磷酸缓冲液（pH值为7.2）：配制磷酸氢二钠和磷酸二氢钠储液，称取磷酸氢二钠138 g和磷酸二氢钠142 g，分别溶于适量水中，待其溶解后定容至1 L;量取 72 mL 磷酸氢二钠溶液和28 mL磷酸二氢钠溶液，混合后即得到pH值为7.2的磷酸缓冲溶液，4 ℃冰箱保存;2.5%戊二醛缓冲溶液：0.2 mol/L磷酸缓冲液50 mL加25%戊二醛溶液10 mL，双蒸水定容至100 mL。

1.1.2 供试培养基 马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基：马铃薯200 g、葡糖糖20 g、蒸馏水1 000 mL，固体加琼脂，120 ℃灭菌20 min;溶菌肉汤（LB）培养基：蛋白胨10 g、酵母膏5 g、NaCl 8 g、蒸馏水1 000 mL，120 ℃灭菌20 min。

1.1.3 菌株来源 解淀粉芽孢杆菌LZN01于2016年4月从黑龙江省齐齐哈尔市扎龙自然保护区采集的腐殖土和黑龙江省田雨绿色农业工程有限公司的鸡粪堆肥中取样，并经常温（30 ℃）及高温（50 ℃）多代驯化、筛选得到;尖孢镰刀菌由东北农业大学园艺实验室提供。

1.2 菌种鉴定

1.2.1 生理生化鉴定 生理生化试验方法参照《常见细菌系统鉴定手册》[14]，接触酶试验、淀粉水解试验、V-P试验、耐盐性试验（2、5、7、10、20 g）、柠檬酸铵利用试验、酷素水解试验方法均参照文献[15]。

1.2.2 菌株16S rDNA测序 以LZN01菌株基因组DNA为模板，采用细菌通用引物sgF：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′;5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′进行PCR扩增。反应体系为2.0 μL10×Ex Taq buffer，1.6 μL 2.5 mmol/L dNTP Mix，0.8 μL Primer 1，0.8 μL Primer 2，0.5 μLTemplate，0.2 μL 5 U Ex Taq，14.1 μL ddH2O。反应条件为：95 ℃ 5 min;95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，24个循环;72 ℃延伸10 min。序列由上海美吉生物医药科技有限公司进行测定，菌株测序结果于NCBI进行Blast比对，鉴定菌株[16-17]。

1.3 解淀粉芽孢杆菌LZN01对FON菌丝生长的影响

解淀粉芽孢杆菌LZN01菌株对FON菌丝生长的影响：采用平板对峙培养法，在PDA平板中央接入已培养5 d的FON菌碟（直径为5 mm），培养48 h后，在距致病菌2 cm处接入已培养24 h的解淀粉芽孢杆菌LZN01，置于30 ℃恒温暗箱中5 d，以不接解淀粉芽孢杆菌LZN01的平板为对照，待对照组菌株长至满盘时观察[18]。

解淀粉芽孢杆菌LZN01上清液对FON菌丝生长的影响[19]：将解淀粉芽孢杆菌LZN01菌体接入盛有100 mL LB液体培养基中，30 ℃、200 r/min振荡培养12 h，制成种子液。再将1 mL种子液接种于100 mL LB液体培养基中，30 ℃、200 r/min振荡培养48 h后，在10 000 r/min、4 ℃条件下离心15 min，取上清液，再将上清液用0.02 μm过滤器过滤，即得发酵上清液，保存于4 ℃冰箱备用。

将解淀粉芽孢杆菌LZN01发酵上清液与未凝固的培养基按体积比1 ∶ 1、1 ∶ 3混合，以培养基与无菌水按同样比例混合作为空白对照，待培养基凝固后，在平板上接种FON菌碟（直径为5 mm），30 ℃培养5 d（3组平行试验），待对照菌落长满平板2/3时，用十字交叉法测量病原菌菌落直径，计算抑菌率。

1.4 解淀粉芽孢杆菌LZN01上清液对FON形态的影响试验

挑取PDA平板中培养5 d的FON菌丝悬浮于无菌水中，经过6层纱布过滤后，室温下10 000 r/min离心5 min收集孢子，用PDA培养基制备孢子悬浮液并调节浓度至 106 CFU/mL。将解淀粉芽孢杆菌LZN01上清液与FON孢子悬液按体积比1 ∶ 1混合后，放入培养皿（铺着已灭菌的湿润滤纸）中，以无菌水与FON的孢子悬液按同样比例混合作为空白对照，在30 ℃黑暗条件下培养12 h。分别吸取混合液滴在盖玻片上风干，使用2.5%戊二醛缓冲液固定，置于4 ℃冰箱中过夜，再用pH值为7.2的磷酸缓冲液将其固定，冲洗2次，依次将样品置于浓度为50%、70%、80%、90%、100%乙醇溶液中脱水置换，每级脱水时间为10～15 min，最后置换100%乙醇加无水硫酸铜脱水10～15 min，置于冷冻室固化1夜，每组3个平行，扫描电镜下观察其形态[20]。

1.5 解淀粉芽孢杆菌LZN01上清液对FON孢子萌发的影响

按“1.4”节中方法制备孢子悬浮液，向已灭菌的离心管中加入10 μL孢子悬液，按体积比1 ∶ 1加入解淀粉芽孢杆菌LZN01上清液，以同样比例的FON孢子悬液和无菌水为对照，混合均匀后，倒入无菌凹玻片中，放在铺有湿润滤纸的培养皿中，30 ℃黑暗条件下培养，每组3个平行试验。分别在6、12、24 h时镜检，观察孢子萌发情况。按下列公式计算孢子萌发抑制率。

孢子萌发率=孢子萌发数总孢子数×100%;

孢子萌发抑制率=对照孢子萌发率-处理孢子萌发率对照孢子萌发率×100%。

1.6 解淀粉芽孢杆菌LZN01上清液抑菌能力的稳定性试验

1.6.1 pH值对抑菌能力的影响 将发酵上清液分别用 1 mol/L HCl或0.5 mol/L NaOH调节pH值为3、4、5、6、7、8、9、10，处理1 h，再将pH值调回到初始pH值（初始pH值为6.6），测定其抑菌活性，以无菌水作对照，比较处理前后菌丝变化情况，计算抑菌率。

1.6.2 温度对抑菌能力的影响 将发酵上清液分别置于-20、0、4、20、60、80、100、120 ℃条件下保温30 min，室温平衡 3 min 后测定解淀粉芽孢杆菌LZN01对FON的抑菌率。

2 结果与分析

2.1 菌种鉴定

菌株解淀粉芽孢杆菌LZN01生理生化指标鉴定见表1，接触酶试验阳性，淀粉水解试验阳性，V-P试验阳性，不能利用柠檬酸铵，酷素水解试验阳性。菌株在NaCl含量>5%的固体培养基中不生长。

2.2 解淀粉芽孢杆菌LZN01对FON菌丝生长的影响

平板对峙试验表明，当对照FON（图2-A）长满培养皿时，试验组FON的生长呈现规避解淀粉芽孢杆菌LZN01的现象（图2-B），说明解淀粉芽孢杆菌LZN01能够抑制FON的菌丝生长;当解淀粉芽孢杆菌LZN01发酵上清液与培养基按体积比1 ∶ 1和1 ∶ 3比例混合后，FON菌落直径分别为 2.77、1.79 cm（图2-C、图2-D），其抑菌率分别为34.82%、57.07%，说明解淀粉芽孢杆菌LZN01能够显著抑制FON的生长。

2.3 解淀粉芽孢杆菌LZN01对FON微观形态的影响

本试验用解淀粉芽孢杆菌LZN01发酵上清液处理FON后，通过电镜观察发现，FON菌丝数量明显减少，菌丝变细，表面变得粗糙、模糊，菌丝末端膨大变形（图3-B），说明FON菌丝生长受到抑制且细胞表面受损（图3）。此结果与菌落生长受抑制的试验结果一致。

2.4 解淀粉芽孢杆菌LZN01对FON孢子萌发的影响

由图4可知，FON孢子悬液与解淀粉芽孢杆菌LZN01上清液按体积比1 ∶ 1混合，培养6、12、24 h后的孢子萌发率分别为2.40%、18.20%、42.17%，孢子萌发抑制率分别为 86.21%、67.50%、56.05%，随着时间的增加孢子萌发抑制率呈下降趋势，可以看出解淀粉芽孢杆菌LZN01能显著抑制FON的孢子萌发。

2.5 解淀粉芽孢杆菌LZN01抑菌能力的稳定性试验

由图5可知，温度在-20 ℃～60 ℃時，发酵上清液的抑菌活性较为稳定，抑菌率基本保持在40%左右，当温度高于 80 ℃ 时抑菌活性快速减弱，在100、121 ℃时抑菌率仅为 4.33%、2.20%。pH值在4～9范围内抑菌率稳定且维持在60%左右，而在此范围内pH值为6时抑菌率为56.12%，低于其他pH值时的抑菌率。因此，解淀粉芽孢杆菌LZN01发酵上清液的抑菌功能物质在pH值为4～9、-20 ℃～60 ℃温度下生长能发挥更好的抑菌作用。

3 结论与讨论

解淀粉芽孢杆菌LZN01对FON具有很好的抑菌效果，对FON孢子的萌发抑制作用显著;FON在被解淀粉芽孢杆菌LZN01发酵上清液处理后，菌丝表面有严重受损现象;解淀粉芽孢杆菌LZN01发酵产生的抑菌物质热稳定性较好，耐酸耐碱，具有良好的应用前景。

芽孢桿菌的筛选及其抑菌功能的研究对农业生物防治极其重要[19]。笔者所在实验室从西瓜根际分离得到一株解淀粉芽孢杆菌LZN01，对FON具有很强的抑制作用。目前，国内外的拮抗菌株对FON的抑制率较低，其中对香蕉枯萎病菌的抑制率为41%[21]，拮抗细菌对棉花枯萎病菌的抑制率为32%[22]，解淀粉芽孢杆菌HAB-7对芒果炭疽菌的抑制率为52.03%[23]，解淀粉芽孢杆菌对西瓜枯萎病的防治效果为 48.78%[24]。与前人研究结果相比，笔者所在实验分离得到的解淀粉芽孢杆菌LZN01对FON的抑菌率达57.07%，抑菌效果显著，具有很大的开发和应用价值。

通过扫描电镜观察被解淀粉芽孢杆菌作用的病原真菌FON菌丝细胞发现，FON菌丝数量明显减少，菌丝边缘变模糊，菌丝末端膨大变形，表明解淀粉芽孢杆菌抑制了病原真菌菌丝的正常生长，与前人研究结论[15，25-27]一致。解淀粉芽孢杆菌分泌的抗菌蛋白[15]或脂肽类物质[27]在FON细胞膜上形成孔道，造成细胞内物质泄漏。导致电化学势的丧失，细菌最终不能保持正常渗透压[28-29]，从而导致细胞的死亡[26，30]。因此，可以推测解淀粉芽孢杆菌LZN01能够分泌某些抗菌物质，从而达到抑制病原真菌的目的[19]。水稻根系分泌物对FON孢子萌发的抑制率可达37.8%～41.0%[31]，青霉菌、放线菌株和石灰水对FON孢子萌发抑制率为21.49%～71.97%[32]，拮抗细菌对香蕉枯萎病菌孢子萌发抑菌率为 53.3%～80.2%%[22]。本研究的解淀粉芽孢杆菌LZN01发酵上清液对FON孢子悬浮液6 h抑制率为86.21%，高于已报道的生防菌株，优势明显。

解淀粉芽孢杆菌CMN1308随温度的升高抑菌效果增加[33]，而本研究温度在-20 ℃～60 ℃时抑菌效果稳定，80 ℃ 以上抑菌率急速下降;解淀粉芽孢杆菌CMN1308只耐碱[22]，而本研究中pH值为3～10范围内均有抑制效果，pH值在4～9范围内抑菌率在60%左右。解淀粉芽孢杆菌LZN01发酵产生的抑菌物质热稳定性较好，耐酸耐碱，为探索西瓜枯萎病生物防治技术和微生物制剂的开发与应用提供了理论与技术支持。

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