范佳祺 朱俊萍 何秋水

首都医科大学基础医学院病原生物学系,北京100069

WHO 最新数据显示,下呼吸道感染仍居世界死亡原因第四位[1]。呼吸道合胞病毒 (respiratory syncytial virus,RSV)和人鼻病毒 (human rhinovirus,HRV)是导致婴幼儿下呼吸道感染最常见的病毒性病原。其中,RSV 感染是造成婴幼儿毛细支气管炎及肺炎的主要原因。每年全球5岁以下儿童中,大约3.4亿遭受RSV 感染,约340万需住院治疗[2]。此外婴儿期下呼吸道感染RSV,至少有30%的患儿可发生哮喘,且高达20%的RSV 感染患儿需要重症监护[3]。HRV 感染则是人类最常见的病毒感染,常会引发从普通感冒到哮喘以及COPD 等不同严重程度的呼吸道疾病[4]。受HRV 感染后,大约15%～30%的婴幼儿会引发呼吸系统相关疾病,尤其是小于两岁的患儿[5]。目前尚无针对RSV 和HRV 的疫苗及有效的抗病毒治疗措施[6-7]。近期研究显示,呼吸道病毒感染后可导致呼吸道菌群失调及致病菌过度生长,而婴幼儿早期的呼吸道菌群构成决定之后的呼吸道菌群发展模式和呼吸道的健康。呼吸道菌群的组成和功能改变可能影响局部的免疫状态以及局部感染性疾病的发展[8-11]。RSV 与 HRV 这两种重要的婴幼儿呼吸道病毒的感染与呼吸道菌群的关系近年来逐步引起关注,我们就此进行综述与展望。

1 RSV与HRV及相关疾病

RSV 属于副黏病毒科,为有包膜的单股负链RNA 病毒,基因组长度约15 kb,包膜由F 和G 糖蛋白组成。RSV 是婴幼儿肺炎和细支气管炎的主要病原体,其感染具有高发病率和高病死率的特点[12],已有明确证据证实RSV诱导细支气管炎可损坏气道以至于气道阻塞和引发喘息[13]。RSV 感染是诱发或加重婴幼儿哮喘的重要危险因素[14]。多数婴儿在2岁之前至少感染过一次RSV,同时该病毒也被认为是心血管疾病或免疫功能不全的老年患者呼吸道感染的重要原因[15]。RSV 的流行时间一般从秋季到初春,其感染率随人群年龄增长而下降[16]。RSV 的感染常局限于呼吸道黏膜。T 淋巴细胞应答缺陷人群感染RSV 后会导致严重疾病。大量针对RSV 感染所致的喘息性疾病的研究发现,Th2类细胞因子分泌增多,Th1/Th2免疫调节失衡,从而促进炎症反应[15];另有研究显示该疾病过程中Th17分化亢进,Treg分化减弱[17],Th17/Treg紊乱[18-19]。

HRV 属于小RNA 病毒科,为无包膜的单股正链RNA病毒,基因组长度约7.2 kb。自1956 年分离出第一株HRV,至今已发现100多个血清型。HRV 又分为A、B和C三种基因型[20]。HRV 是引起人类病毒性呼吸道感染的最常见病原体,多数 HRV 通过细胞间黏附分子1(intercellular adhesion molecule 1,ICAM-1)介导进入细胞,是成人和儿童普通感冒的最常见病因。研究发现HRV不仅可引起上呼吸道感染,且与细支气管炎、肺炎、哮喘加重等下呼吸道疾病密切相关[21]。HRV 感染全年均可发生,一般春秋季高发,人群普遍易感,其中儿童感染率较高,发病率随年龄增长逐渐下降[22]。多项研究表明HRV感染是引起哮喘急性发作和 (或)哮喘加重的主要原因之一,但确切机制还不完全清楚。HRV 感染后可通过上调ICAM-1的表达,诱导中性粒细胞、淋巴细胞、嗜酸粒细胞等炎性细胞在呼吸道黏膜及黏膜下层浸润和积聚,分泌多种炎性细胞因子,如IL-2、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、IL-13、IL-16、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor,GMCSF)、调节正常T 细胞表达、分泌活性因子和组胺,加重呼吸道炎性反应[23-24]。

2 呼吸道菌群

人体不同部位的细菌种类及数量不同,正常情况下各部位菌群保持相对平衡的状态。人体呼吸道以环状软骨为界分为上、下呼吸道,上呼吸道包括：鼻、鼻窦、咽喉,下呼吸道包括气管和各级支气管。研究发现上呼吸道菌群数量多于下呼吸道,但在菌群多样性方面上下呼吸道并没有太大差别[17]。

健康人群呼吸道五大主要菌门包括：厚壁菌门、拟杆菌门、变形菌门、放线菌门和梭菌门,其中厚壁菌门是呼吸道优势菌门。有研究显示,厚壁菌门的链球菌科和拟杆菌门的普雷沃菌科为呼吸道优势菌科[17],而放线菌门、变形菌门和梭菌属则为呼吸道菌群的次要组成部分[18]。呼吸道正常菌群是机体的天然屏障,既能拮抗外来病原的入侵和繁殖,还对呼吸道局部黏膜免疫的发育和成熟发挥重要作用[19]。婴幼儿呼吸道菌群组成伴随成长发育不断成熟,随着机体免疫功能的不断完善,定植在呼吸道黏膜表面的致病菌数量逐渐减少,菌群结构趋于稳定。新生儿出生后体内经历无菌到有菌的过程,初步形成由正常菌群构成的微生态系统。研究发现,新生儿在出生第1周呼吸道定植菌即发生改变,且大多数新生儿在出生7 d内会建立一个优势菌群[25-27],而平均月龄12个月的婴儿其呼吸道内的致病菌肺炎链球菌和卡他莫拉菌的数量以每个月2%的速度递减[28]。

呼吸道菌群组成受多种因素影响,例如年龄、分娩方式、是否母乳喂养、是否饲养宠物、人体所处环境以及是否使用抗生素等[29]。而呼吸道菌群与宿主免疫应答的研究主要集中于过敏性疾病和慢性呼吸道疾病,如：哮喘、COPD 等。疾病发生后呼吸道内菌群稳态遭到破坏,同时宿主的免疫应答发生改变,尤其是局部免疫应答。一方面,呼吸道微生态环境的改变能影响宿主的免疫反应,另一方面,宿主免疫状态改变也可以影响局部微生物族群的构成[30]。病毒感染情况下,呼吸道菌群稳态被干扰,致病菌定植加剧从而导致疾病恶化。而某些细菌如假白喉棒状杆菌和乳酸杆菌等,则可通过参与和调节宿主免疫应答,抵抗病毒的侵袭。细菌与病毒间的相互作用影响呼吸道病毒感染的发生、发展和预后。

3 呼吸道病毒感染对呼吸道菌群组成的影响

研究发现,RSV 与HRV 感染可造成呼吸道菌群失调及致病菌过度生长。

RSV 感染者鼻咽部主要分布有：嗜血杆菌属、链球菌属、莫拉菌属、棒状杆菌属和葡萄球菌属。普雷沃菌属、无色菌、奈瑟菌及韦荣球菌为次要菌属。与健康人相比,RSV 感染者呼吸道嗜血杆菌明显过度生长[31](表1)。

Korten等[32]研究了一岁以下婴幼儿感染HRV 导致的鼻腔菌群结构的变化,发现相较于无症状感染组,有症状的HRV 感染患儿菌群α多样性降低。β多样性分析发现,两组间存在差异并且有症状HRV 感染组呼吸道细菌的密度更高。另有调查[33]显示,健康青少年在感染HRV 前、感染期间和感染后的鼻腔灌洗液中,感染HRV 个体的鼻腔菌群多样性显著下降,同时棒状杆菌属和普氏厌氧球菌属的丰度降低,丙酸菌属和莫拉菌属的丰度增加 (表1)。Hofstra等[34]检测HRV16感染的60名健康志愿者的咽拭子发现,病毒感染导致上呼吸道流感嗜血杆菌与奈瑟菌属成员数量明显上升,同时葡萄球菌属成员存在较微弱的上升趋势 (表1)。

表1 RSV、HRV 感染不同宿主所引起的呼吸道菌群变化与相关免疫反应

Rosas-Salazar等[35]比较分析了分别被RSV 和HRV 感染的83名和52名婴幼儿的鼻咽部菌群组成,发现这两种病毒感染者的菌群组成以及某些特定菌种的丰度存在显著性差异,有19 个菌属的丰度明显不同,特别是葡萄球菌属,相较于HRV 感染,RSV 感染的婴幼儿鼻咽部葡萄球菌数量明显增高 (表1)。

Molyneaux等[36]研究发现,COPD 患者感染 HRV 后,呼吸道菌群组成改变,定植细菌数量增加,继发细菌性感染呼吸道菌群中厚壁菌门数量下降12%,拟杆菌门数量下降5%,流感嗜血杆菌数量增加21%,奈瑟菌数量增加9.5% (表1)。此外,早产儿与足月婴儿在感染HRV 后,其鼻咽部菌群存在显著差异。与足月婴儿相比,早产儿鼻咽部菌群中变形菌门、嗜血杆菌属和莫拉菌属数量上升,厚壁菌门和链球菌数量下降 (表1)。此外呼吸道菌群成员的数量及组成由异常恢复到正常水平的能力相对较弱。这些与早产相关的鼻咽部菌群组成的变化远远超出了新生儿阶段的正常菌群改变。这种成熟前相关鼻咽部菌群特征在HRV 感染过程中持续存在,同时呼吸道炎症和免疫反应等状态也存在差异,提示早产儿鼻咽部菌群组成在呼吸道炎症和免疫应答调节中发挥重要作用[37]。

4 菌群改变及特殊菌对呼吸道病毒感染的影响

4.1 某些细菌可增强机体抗RSV、HRV 感染的能力 动物实验中发现,RSV 感染可导致小鼠肺功能改变、诱导肺组织损伤并且启动炎症反应。病毒感染导致气道分泌大量促炎因子,如肿瘤坏死因子α (tumor necrosis factorα,TNF-α)、IL-6、IL-8、巨噬细胞炎性蛋白1 (macrophage inflammatory protein 1,MIP-1)、T 细胞表达和分泌活化因子 (regulation upon activation normal T cell expressed and secreted,RANTES)、人单核细胞趋化蛋白1(monocytechemotacticprotein-1,MCP-1)和I 型干扰素等[38],这些促炎因子在病毒感染早期有利于病毒清除,但促炎因子持续表达则可在感染后期加重组织损伤。因此机体平衡炎症反应的能力至关重要。既要在病毒感染早期及早启动有效的炎症应答,清除病毒,又能在病毒感染后期限制强烈的炎症反应以避免过度的免疫病理损伤。

呼吸道菌群是宿主免疫防御的参与者和重要调控者,其可通过GM-CSF 信号通路提高机体抗肺部感染的能力[39],并且决定肺部局部免疫状态和上皮屏障的功能[40]。研究显示,下呼吸道菌群在调节机体天然免疫与获得性免疫中均发挥重要作用,其可通过影响γδT 细胞的功能和减少Th2型细胞因子分泌两方面来调节抑制过敏性气道的高炎症反应[32]。

近期在小鼠感染模型的研究中发现[41],活的假白喉棒状杆菌可通过调节小鼠呼吸道Toll样受体3 (Toll like receptor 3,TLR3)介导的先天抗病毒免疫应答提高机体对原发RSV 感染的抵抗能力。实验小鼠共分3 组,其中一、二组小鼠连续5 d鼻部分别接种相同浓度的活和经高温灭活的假白喉棒状杆菌090104,第3组小鼠为不经菌预处理的对照。小鼠鼻部接种5 d后,在第6天三组小鼠同时感染RSV。相较对照组,一组小鼠的肺部CD3+CD4+IFN-γ+T 细胞,CD3+CD4+IL-10+T细胞以及CD11c+SiglecF+IFN-β+肺泡巨噬细胞数量增加,且该组小鼠的支气管肺泡灌洗液中IFN-γ浓度显著增加,IFN-β浓度微弱增加 (表2)。相较对照,二组小鼠相关免疫细胞的总体数量没有变化,支气管肺泡灌洗液中IFN-γ浓度的上升也较少。一二组对比发现,一组小鼠支气管肺泡灌洗液中RSV载量低、乳酸脱氢酶含量低、白蛋白浓度低,经活菌预干预的小鼠在RSV 感染后健康状况恢复良好。而二组小鼠体质量在恢复期没有得以改善,支气管肺泡灌洗液中RSV 载量高。由此可见,假白喉棒状杆菌这种呼吸道共生菌具备作为益生菌制剂应用临床的潜力。研究发现其可通过间接调节宿主免疫应答辅助控制病原体,减少肺炎链球菌定植与金黄色葡萄球菌的继发感染,促进炎症反应的良好控制。但假白喉棒状杆菌活菌的使用也可能存在潜在风险,尤其是免疫系统尚未发育成熟的婴幼儿以及免疫力低下的成年人,老年人等特殊人群需要特殊关注,真正能够应用于临床需要进一步的实验验证。

表2 RSV 感染以不同方式接种共生菌、益生菌的小鼠所引起的相关免疫反应

肠道益生菌也可有效保护人体呼吸道[42]。Tomosada等[43]研究小鼠感染模型中发现,鼠李糖乳酸杆菌的存在可以提供机体抗RSV 感染的能力,其具体机制不清,推测可能参与了宿主的免疫调节,从而实现对呼吸道黏膜的保护。将两种乳酸杆菌CRL1505 (Lr05)和CRL1506 (Lr06)分别接种不同小鼠的鼻腔后发现,虽然二者都可以降低RSV感染的风险,但 Lr05 主要诱导 CD4+Th1 细胞IFN-γ 和CD4+Treg细胞IL-10的产生,而且该过程中树突状细胞也发挥了重要作用。而Lr06 则主要调节上皮细胞IFN-α、IFN-β以及IL-6 的表达 (表2)。此外两组实验动物中TLR3与维甲酸诱导基因1的表达可能也与抗RSV 感染的保护机制有关。

越来越多的研究显示,机体正常菌群无论是在局部(呼吸道)还是远端 (消化道)都可发挥对呼吸道的保护作用,其机制可能通过调节局部和全身的炎症及免疫反应来实现。相关的炎症和免疫应答类型因菌种的不同而存在差异,可能与特异细菌的蛋白质、细胞壁上多糖的修饰,DNA中CpG含量、代谢产物以及细菌分泌的小分子物质有关[44]。此外,肠道益生菌还可在肠道内被肠道黏膜派氏结的M 细胞捕获,刺激巨噬细胞、T 细胞及其他细胞,这些免疫细胞迁移至肠系膜淋巴结并可随淋巴及全身血液循环至肺及其他脏器发挥调节作用。

临床研究发现,肠道菌群变化可以改变哮喘患者对过敏因素的反应。RSV 诱导的哮喘急性发作的小鼠模型中,口服约氏乳杆菌可降低小鼠气道高反应性,减轻以中性粒细胞减少为特征的肺部炎症反应以及减少气道产黏液的杯状细胞数量;肺组织中Th2细胞因子IL-4、IL-5、IL-13和IL-17水平明显降低[45],可见约氏乳杆菌可以明显改善RSV 诱导的哮喘反应 (表2)。

临床研究还发现口服益生菌也可有效抵抗HRV 的感染,保护呼吸道健康[46]。94名早产婴儿在出生3～60 d内口服益生元和益生菌后发现,服用益生元益生菌的婴儿较服用安慰剂组婴儿相比,HRV 感染的发生率更低。但是目前相关益生菌制剂的研究仍在进行之中,保护机制有待进一步阐析。

4.2 某些呼吸道致病菌可增加呼吸道病毒的致病性及所致疾病的严重程度 RSV 与HRV 的感染造成呼吸道菌群失调,同时促进致病菌定植以及致病菌数量增加。有资料显示60%～70%健康成年人和儿童的鼻腔中存在肺炎链球菌、流感嗜血杆菌以及卡他莫拉菌。这些致病菌的定植可增加机体对病毒的易感性,使病毒更易于侵入机体,并能使病毒感染相关疾病进一步恶化[47]。

RSV 感染造成咽部菌群失调可进一步导致病毒感染后期气道高反应,抑制肺部Treg细胞的增殖以及抑制肺部CD11c+细胞的成熟[48],打破机体免疫平衡,加重疾病的严重程度。有研究显示机体在感染RSV 后,呼吸道先存菌群也可通过引发促炎反应进一步加重病情[49]。

实验证明,RSV 在体内的复制、侵袭与流感嗜血杆菌的定植密切相关[50]。RSV 初次感染造成的呼吸道流感嗜血杆菌定植与后续病毒再次感染的易感性有关。体外实验证实,流感嗜血杆菌定植可促进RSV 复制,促进呼吸道上皮细胞释放前炎性细胞因子IL-6 和IL-8。Ederveen等[31]发现RSV 感染者鼻咽冲洗液中的病毒载量与鼻咽部菌群组成明显相关。健康婴儿 (n=21)与RSV 感染婴儿 (n=54)的菌群谱明显不同,主要差别是RSV 感染患儿鼻咽部韦荣球菌等共生菌减少,同时如嗜血杆菌和无色菌等条件致病菌增多。CXCL8是先前研究发现的一种可预示疾病严重程度的生物标志物。该研究发现,在不同的CXCL8水平下,病患鼻咽部的菌群明显不同,而且发现嗜血杆菌的丰度是CXCL8水平最强的预测指标。但是目前仅能证实呼吸道菌群改变与疾病严重程度相关,尚无法证明其因果关系。有研究调查了136例患RSV 细支气管炎的婴幼儿,相较于同龄健康婴幼儿,发现定植有莫拉菌属和流感嗜血杆菌的细支气管炎组患儿血清中IL-6和IL-8的浓度更高,同时呼吸道菌群的变化可能引发了中性粒细胞的招募和活化增强,最终导致RSV 疾病进一步加重[51](表1)。

研究发现,HRV 感染造成的呼吸道菌群失调,有利于卡他莫拉菌与肺炎链球菌等潜在致病菌的定植,加重疾病的发展[52],而流感嗜血杆菌的定植则会诱导ICAM-1 与TLR3表达,继而增强HRV 对上皮细胞的黏附以及相关细胞趋化因子的产生[53](表1)。

此外,像婴幼儿、老年人、免疫功能不全等特殊人群,其被病毒感染后可能会引发一系列其他疾病,后果更为严重。

4.3 呼吸道菌群与RSV、HRV 感染引起的细支气管炎和哮喘 细支气管炎常由RSV 和HRV 感染引起,其中RSV为主要病原体。两岁以下的婴儿、过敏体质、免疫功能不全等特殊人群更易在感染RSV 后引起细支气管炎。

当人体感染RSV 后,呼吸道定植细菌数量增加,流感嗜血杆菌明显过度生长,链球菌属、莫拉菌属的定植,促使疾病从上呼吸道感染进展到下呼吸道[54],RSV 进入肺部引起细支气管炎。Yang等[55]研究发现,肺炎链球菌感染出生1周的小鼠,可引发Th17 型炎症反应以及气道高反应性。Th17表型与肺FoxP3+Treg细胞受损相关。同时有研究观察到RSV 感染后引起细支气管炎的婴幼儿中,Treg细胞数量减少[56]。推测肺炎链球菌在呼吸道的早期定植抑制了Treg细胞反应,无法抑制和平衡机体过高的炎症应答,导致宿主更易受过敏性气道炎症的影响,增加了RSV感染后疾病的严重程度 (表1)。

研究发现不同病毒感染后引起的细支气管炎疾病中,呼吸道菌群的组成并不相同。Mansbach 等[57]研究发现,1 016例患毛细支气管炎婴儿的鼻咽分泌物,检测出RSV和/或 HRV 感染的样品有730 份。其中580 份仅 RSV 感染,发现其呼吸道菌群中厚壁菌门和链球菌属丰度高,而变形菌门、嗜血杆菌属和莫拉菌属丰度低;而60 份仅HRV 感染的样品检测结果则与之相反,厚壁菌门和链球菌属丰度低,而变形菌门、嗜血杆菌属和莫拉菌属丰度高;另外100份RSV 和HRV 共感染样品中,上述菌群的丰度介于两组病毒单独感染的样本检测结果之间。提示不同病毒病原感染可引起呼吸道菌群呈现出特征性的变化。

哮喘是一种公认的呼吸系统免疫功能紊乱性疾病,其被定义为由病毒性上呼吸道感染、环境过敏原或其他刺激引起的间歇性呼吸症状的临床综合征,其特征是非特异性气管高反应性和气道炎症。

肺部菌群失调可能是引起哮喘综合征的原因之一。比较轻度持续性哮喘患者与健康人的痰液菌群,发现轻度持续性哮喘患者其痰液中厚壁菌门和放线菌门数量下降,变形杆菌数量上升[58]。马欢[59]则比较了哮喘急性发作期患者与健康人鼻腔菌群的组成,发现哮喘患者表现为鼻腔菌群失衡,以单一的葡萄球菌属为主,可能导致呼吸道屏障作用降低 (表1)。同时,不仅呼吸道菌群与哮喘表型存在相关性,哮喘的严重程度也与变形菌门及链球菌属的数量呈正相关。研究发现慢性哮喘患者痰液中菌群多样性大于持续或重度哮喘患者的菌群多样性[52]。

细菌是哮喘源起和恶化的重要参与者。RSV 和HRV感染可促进呼吸道致病菌的感染与定植,嗜血杆菌属、链球菌属和莫拉菌属与呼吸道疾病及哮喘的发展相关。有研究发现,当人体暴露在菌群种类丰富的环境时,可预防哮喘的发展,因此保持呼吸道菌群的多样性似乎可视为预防潜在哮喘发生的策略[54]。此外,呼吸道流感嗜血杆菌的早期定植和机体促炎症免疫反应也与儿童哮喘的发生发展相关[35]。

近年来关于RSV 和HRV 引起哮喘的相关免疫学机制已经广泛研究,而呼吸道菌群在哮喘发生发展中的确切作用尚不明晰,有待进一步探究与确认。

呼吸道病毒感染会导致局部菌群紊乱,包括上呼吸道和下呼吸道;而某些呼吸道致病菌定植则可增加呼吸道病毒的致病性及所致疾病的严重程度,引发儿童细支气管炎和哮喘等疾病。机体远端如肠道菌群组成的改变可通过对全身免疫状态的影响干预呼吸道对病原感染的防御。提示通过干预局部及远端的菌群组成可以调节机体对呼吸道病毒的易感性及相关疾病的严重程度。动物实验中给予 (口服或鼻部滴注)益生菌似乎都可有效改善呼吸道病毒对肺组织损害程度,但实际临床观察中效果并不明显。导致实验室和临床效果之间差异的原因尚需深入探讨,另外对伴有不同疾病的病毒易感者使用益生菌是否存在风险,尤其是免疫缺陷患者,还需要进一步的动物实验和临床观察进行确认[60]。

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