任欣欣 李志惠 冯秀莉 崔丹 赵杰

河北省胸科医院结核一科,石家庄050041

中国是全球结核病发病率第二高的国家,仅次于印度,流行病学调查显示,我国有近5.5亿人感染结核菌,近年来发病率呈明显升高趋势[1]。而且由于抗菌药物的大量应用,临床上耐药结核菌株出现越来越多,增加了治疗难度,使患者病程延长、传染性增强、花费增多甚至病死率升高[2]。目前诊断肺结核的方法主要包括标本抗酸染色、PPD试验、结核菌培养和PCR 技术等[3],标本抗酸染色结果受标本质量影响大,检出率低,PPD 试验是简洁检测方法,结核菌培养需要时间长,PCR技术对标本要求高,检出率也偏低,这些方法均存在不同程度缺陷,难以应用于早期诊断,且检查时间跨度较大,费用高,延误治疗患者的时间,增加了患者工作生活负担,故寻求一种快速、廉价、早期诊断结核病的方法成为本研究的热点。利福平耐药实时荧光定量核酸扩增检测技术 (rifampicinresistant real-time fluorescence quantitative nucleic acid amplification detection technology,X-pert MTB/RIF)是一种新型检测方法[4],在检测结核分枝杆菌基因的同时,进行利福平耐药检测,可以快速诊断初始耐药结核病,并且操作简单。故在本次研究中,对河北省胸科医院收治的初治肺结核患者采用X-pert MTB/RIF方法诊断,分析此方的敏感度和特异度,拟为初始耐药结核病患者的早期治疗方案的制定提供依据,现将结果报道如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象 本次研究采用全面筛查的方式,收集河北省胸科医院2015年1月至2018年2月所有初治诊断为疑似肺结核肺患者356例,统计患者相关的临床症状和表现[5],了解患者病史和治疗(包括初治和复治)信息,通过临床筛选出疑似耐多药结核病[6](suspected drug-resistant tuberculosis,SDR-TB)患者125例以及痰涂片及临床诊断肺结核患者231例。在所有的125例疑似MDR-TB患者中,包括23例为临床已诊断耐药性肺结核,35例在临床进行常规一线抗结核治疗1疗程以上并且复查痰涂片未转阴者;18例复治失败者;12例病史中有耐药性肺结核患者接触和疑似传染史。在本次研究纳入的患者中,男性为189例,占53.09%;女性为167例,占46.91%。男性年龄 (53.45±10.23)岁,年龄范围35～67 岁,女性年龄 (52.29±9.87)岁,范围40～65岁,男女性患者一般情况差异无统计学意义 (P＞0.05),并且符合肺结核的流行性分布。本次试验已通过伦理审查委员会批准 (20141234),所有患者知情同意。

1.2 纳入标准 主要纳入标准为WS288-2008肺结核诊断标准[7],其中纳入患者为诊断为肺结核的患者。

1.2.1 临床诊断病例标准 (凡符合下列项目之一者) (1)肺结核临床表现和体征+肺部影像学典型表现;(2)肺部影像学典型表现+结核菌素试验强阳性 [硬结平均直径≥20 mm (儿童≥15 mm)或局部出现水疱、坏死及淋巴管炎];(3)肺部影像学典型表现+抗结核抗体检查等其他辅助诊断方法;(4)肺部影像学典型表现+肺外组织病理检查证实为结核病变者;(5)疑似肺结核病例经诊断性治疗或随访观察可排除其他肺部疾病者。

1.2.2 确诊病例 痰涂片阳性肺结核诊断 (凡符合下列项目之一者)： (1)2份痰标本涂片抗酸杆菌检查阳性;(2)1份痰标本涂片抗酸杆菌检查阳性+肺部影像学典型表现;(3)1份痰标本涂片抗酸杆菌检查阳性+1 份痰标本结核分枝杆菌培养阳性。

仅分枝杆菌分离培养阳性肺结核诊断：肺部影像学典型表现+痰标本涂片抗酸杆菌检查阴性+结核分枝杆菌培养阳性。

肺部病变标本病理学诊断为结核病变者。

1.3 排除标准 (1)合并有其他全身系统疾病,或患有可能影响实验结果的相关疾病[8];(2)在采集标本前有进行治疗 (包括正规治疗及自行口服抗结核药);(3)采集标本有污染以及可能污染可能;(4)患者未签署知情同意书。

1.4 仪器及试剂 结核菌培养+药敏：美国BD BECTEC 960快速全自动结核菌培养及药敏检测系统及其试剂盒 (YZB/USA0078-2014)。

胶体金试验 (菌型测定)：胶体金试验试剂盒(由杭州创新生物检控技术有限公司提供)。

X-pert MTB/RIF检测：采用美国Cepheid公司生产的 X-pert MTB/RIF 检测设备 (型号：GeneXpert MTB/RIF)以及试剂盒 (YZB/SWE 0657-2014)。

1.5 方法 将所有纳入标本分为结核菌培养+药敏试验组、X-pert MTB/RIF 检测组和 X-pert MTB/RIF检测 (肺泡灌洗液)组。严格选取每例纳入患者的痰液标本两份,分为结核菌培养+药敏试验组和X-pert MTB/RIF检测组,分别行结核菌培养+药敏试验和X-pert MTB/RIF检测,并对结核菌培养+药敏试验组行胶体金试验,结果分别纳入结核菌培养+药敏试验组和X-pert MTB/RIF检测组。取每例纳入患者的肺泡灌洗液样本一份,登记并行X-pert MTB/RIF 检测,结果纳入X-pert MTB/RIF检测 (肺泡灌洗液)组。

1.5.1 结核菌培养+药敏试验组 将培养管内接种患者标本,然后放置于BECTEC 960快速全自动结核菌检测仪中,置出现阳性结果后,取出样本按药敏试验 (antimicrobial susceptibility test,AST)程序进行菌悬液接种,单次为0.5 ml,然后分别置于浓度为0.1、0.5、1.0、5.0 mg/L 的利福平、异烟肼、链霉素、乙胺丁醇试药管,对照组设生理盐水稀释菌悬液。然后放入BECTEC 960快速全自动结核菌五孔药敏测试仪,按说明规程操作[9],在2周后每天记录结果至5 周。胶体金试验：对结核菌培养报阳的标本取菌液,按使用说明,结合抗酸染色法对报阳标本的菌株类型进行判断[10](当涂片为索状+胶体金阳性为结核分枝杆菌;当涂片为非索状+胶体金阴性为非结核分枝杆菌)。

1.5.2 X-pert MTB/RIF 检测组 将样本离心后取底层液1 ml,掺入NaOH 及异丙醇处理液[11](比例为1∶2),震荡30 s,常温静置15 min后去混合液置于试剂盒,然后采用X-pert MTB/RIF检测设备全自动检测,2 h后记录结果。

1.5.3 X-pert MTB/RIF 检测 (肺泡灌洗液)组操作与X-pert MTB/RIF检测组相同。

1.6 评价指标 X-pert MTB/RIF 检测评价[12]：MTB判读根据DNA 扩增情况分为未检出、极低、低、中、高五个等级。RIF药敏结果分为检出 (耐药)和未检出 (敏感)。

1.7 统计学分析 应用SPSS 17.0进行统计学分析,计数资料采用χ2检验,计量资料采用t检验,检验标准0.05,P＜0.05时有统计学意义,一致性检验采用Kappa检验[13],Kappa≥0.75两者一致性较 好;0.75 ＞ Kappa≥0.4两者一致性一般;Kappa＜0.4两者一致性较差。计量资料以±s表示,组间比较采用成组t检验,P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 纳入患者试验样本质量 本次试验共纳入患者样本356例,其中男189例,女167例,所有样本均符合检验要求,无检验中交叉污染现象,检测数据无记录错误,符合实验质量控制需要[14]。

2.2 数据评估

2.2.1 结核菌培养+药敏法结果评价 对全部356例样本的药敏结果进行分析,利福平耐药共有80例,占总数的22.47%;多菌种耐药共有78例,占总数的21.91%;在利福平耐药中存在两例同时对其他药物敏感。以 MDR-TB 的诊断标准[15]而言,利福平耐药作为简化指标的敏感度为100%(78/78),特异度为99.28% (276/278),阳性预测值为97.50% (78/80),阴性预测值为100%(276/276),Kappa≥0.75,两者一致性较好,见表1。

表1 样本耐药情况对比 (例)

2.2.2 菌型测定结果情况 对全部356例样本的菌型测定结果进行分析,X-pert MTB/RIF 检测的所有样本中,结核分枝杆菌阳性为349例,阴性为7例;以胶体金法检测,阳性为349例,阴性为7例,若以胶体金法为判断结核分枝杆菌的金标准[16],则X-pert MTB/RIF检测的特异度85.71%(6/7),敏感度99.71% (348/356),阳性预测值为99.71% (348/349),阴性预测值为85.71% (6/7),Kappa≥0.75,两者一致性较好,见表2。

表2 结核分枝杆菌检测结果 (例)

2.2.3 耐药度评价 对全部356例样本的耐药性结果进行分析,X-pert MTB/RIF 检测的所有样本中,耐药性阳性为78例,阴性为278例,耐药率为21.91%;以药敏试验检测,阳性为80例,阴性为276例,耐药率为22.47%,若以胶体金法为判断结核分枝杆菌的金标准,则X-pert MTB/RIF检测的特异度100% (276/276),敏感度97.50%(78/80),阳性预测值为100% (78/78),阴性预测值为99.28% (276/278),Kappa≥0.75,两者一致性较好,见表3。

表3 耐药性检验情况比较 (例)

2.2.4 痰标本与肺泡灌洗液标本的结果比较 对全部356例样本的痰标本与肺泡灌洗液标本结果进行分析,X-pert MTB/RIF检测的所有样本中,痰标本耐药性阳性为78例,阴性为278例,耐药率为21.91%;以肺泡灌洗液检测,阳性为79例,阴性为277例,耐药率为22.19%,两组数据Kappa≥0.75,一致性较好,见表4。

表4 痰标本与肺泡灌洗液标本的结果比较 (例)

2.2.5 各组标本检测时间比较 对全部356例样本的痰标本与肺泡灌洗液标本结果进行分析,结核菌培养+药敏法组检测平均时间 (19.43±2.75)d,X-pert MTB/RIF 检测组平均时间为 (2.31±0.12)h,X-pert MTB/RIF 检测 (肺泡灌洗液)组平均时间为 (2.37±0.19)h。X-pert MTB/RIF检测法对痰标本和肺泡灌洗液标本检测时间差异无统计学意义 (P＞0.05),与结核菌培养+药敏法比较显著缩短 (P＜0.05),见表5。

表5 各组标本检测时间比较 (h,±s)

表5 各组标本检测时间比较 (h,±s)

注：与结核菌培养+药敏法组比较,aP ＜0.05

组别 例数 时间结核菌培养+药敏法组 356 19.43±2.75 X-pert MTB/RIF检测组 356 2.31±0.12a X-pert MTB/RIF检测（肺泡灌洗液）组 356 2.37±0.19a F 值 17 593.64P 值 ＜0.001

3 讨论

结核病是由结核分枝杆菌引起的慢性传染病,其可以侵犯人体的各个器官,但主要侵犯部位为肺部,称之为肺结核。早期、联合、适量、规律、全程是肺结核治疗的基本原则[17],其中又以早期诊断发现为重中之重。由于肺结核表现隐匿,检测手段局限,有时常会采用治疗性诊断,这使药物的耐药性控制成为困难。目前的流行病学研究显示[18],耐药性肺结核的患者正在逐年递增,对于MDRTB患者而言,若不能对此进行准确判断,及时采用或更换治疗方案,不仅推迟了患者的疗程,也是医疗资源的极大浪费。近年来,虽然在治疗的药物并未有革命性的突破,但如新型全自动培养、基因检测及X-pert MTB/RIF检测正逐渐在临床一线的快速诊断方面展露头角,为耐药菌的及时发现提供了更多选择,从而使结核菌的耐药趋势得到了遏制。有相关的研究统计数据表明,X-pert MTB/RIF检测在检出结核菌的敏感度和特异度都能达到90%以上,而从2010 年开始,WHO 建议将X-pert MTB/RIF用于医疗条件不佳的国家和地区,也正是看中其检测方便快速,准确率高等特点[19]。而在检测时间方面,X-pert MTB/RIF 具有明显的优势,本次研究中X-pert MTB/RIF检测平均时间分别为 (2.31±0.12)h和 (2.37±0.19)h,与传统高准确率的检测方法相比,可明显缩短患者的诊断时间。这就使X-pert MTB/RIF的适用性不断扩大,可以用于患者早期发现,诊断治疗。

MDR-TB中存在各类耐药菌株,而主要具有临床实际意义的就是对传统抗结核药,即利福平、异烟肼、乙胺丁醇和链霉素这四种一线药物的抗药性,虽然传统的体外药敏实验确实能够对这四种药物进行耐药性检测,但培养时间过长,有时亦不及病情发展速度,无法满足早期诊断的要求。而近年的探针和基因芯片技术,也存在步骤复杂精细,价格昂贵等缺点,不利于大面积推广。而X-pert MTB/RIF虽然只测利福平耐药性,但笔者此次研究的数据结果显示以MDR-TB 的诊断标准而言,利福平耐药作为简化指标的敏感度为100% (78/78),特异度为99.28% (276/278)。而国内其他相关研究的数据虽然有一些差异性[20],但基本都能在95% 以上,因此笔者认为其完全可以作为MDR-TB的快速诊断方案。

目前,临床常用胶体金法结合抗酸染色初步判断患者菌型,而对比X-pert MTB/RIF检测与常规检测的数据发现,两者的一致性较好,而对于胶体金测试阴性的患者,笔者则进一步进行了补充基因芯片检测,这7例中有5例为胞内分枝杆菌、1例为脓肿分枝杆菌。而在X-pert MTB/RIF 检测阳性,胶体金测试阴性的1 例,最后检测为双重感染,目前推测为Rv1908基因突变或缺失所致。对于耐药性结果的显示,X-pert MTB/RIF 与金标准符合率高,特异度100% (276/276),敏感度97.50% (78/80),基本国外的相关研究相符。X-pert MTB/RIF以PCR 技术为基础,检测靶基因rpoB[21],有其独特优点： (1)对菌株的活性无要求;(2)高敏感度和特异度;(3)结果快速。而为了探讨对患者取材是否具有要求,笔者又做了补充试验,探讨不同取材对于X-pert MTB/RIF的检测结果是否存在影响。结果基本一致,令人满意。

综上所述,X-pert MTB/RIF 检测相较于传统检测手段优势明显,能够用于初始诊断肺结核患者耐药性的患者诊断,其敏感度和特异度都令人满意。本次研究限于实际条件,纳入的检测手段较少,笔者后期会进一步增加检测手段,使统计数据更为精确有效。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突