王加良, 张艳丽, 范景辉, 李海燕

(牡丹江医学院附属红旗医院,黑龙江 牡丹江157011)

苏黄止咳胶囊是由牛蒡子、紫苏叶、紫苏子、前胡、五味子、麻黄、地龙、蜜枇杷叶、蝉蜕等中药材加工而成的中成药复方制剂,收载于国家食品药品监督管理局标准(YBZ00172008) 中［1］,方中紫苏叶、麻黄止咳平喘,疏风宣肺,为君药；五味子、蝉蜕止咳化痰,收敛肺气,为臣药；紫苏子、枇杷叶、地龙、前胡止咳化痰,利咽,牛蒡子利咽止痒,为佐药。但苏黄止咳胶囊现行质量标准仅对其所含的盐酸麻黄碱进行定量检测,而姚琴等［2］采用HPLC 法测定其中紫苏醛含有量,尚无多成分同时测定的报道。

中成药复方制剂组成复杂,单一成分定量测定难以全面控制其质量和疗效一致性,多指标成分测定已成为相关质量评价的发展趋势。苏黄止咳胶囊中君药紫苏叶和紫苏子主要含有黄酮、迷迭香酸、咖啡酸、阿魏酸等成分,以迷迭香酸为主；臣药五味子主要含有木脂素、萜类、多糖、有机酸等成分,以五味子醇甲、五味子醇乙等木脂素为主；佐药牛蒡子主要含有牛蒡苷、牛蒡苷元等木脂素,前胡主要含有白花前胡甲素、白花前胡乙素、白花前胡E 素等香豆素。为全面有效地控制该制剂质量,本实验采用一测多评法,以迷迭香酸为内标,建立该成分与牛蒡子苷、牛蒡子苷元、白花前胡甲素、白花前胡乙素、白花前胡E 素、五味子醇甲的相对校正因子,并计算各成分含有量,以期为其质量控制提供参考。

1 材料

1.1 仪器 Waters 2695 型高效液相色谱仪(美国Waters 公司)；AL204 型电子天平［梅特勒-托利多仪器(上海) 有限公司］；SK5200H 型超声波清洗器(上海科导仪器有限公司)。

1.2 试药 白花前胡甲素(111711-201703,含有量98.8%)、迷迭香酸 (111871-201706, 含有量90.5%)、白花前胡乙素(111904-201203,含有量98.0%)、五味子醇甲 (110857-201714, 含有量99.9%) 对照品均购自中国食品药品检定研究院；牛蒡子苷(20362-31-6)、牛蒡子苷元 (7770-78-7)、白花前胡E 素(78478-28-1) 对照品均购自上海纯优生物科技有限公司。苏黄止咳胶囊(每粒装0.45 g,批号17120812、18040311、18042111)购自扬子江药业集团北京海燕药业有限公司。甲醇为色谱纯；其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Hypersil ODS C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)；流动相甲醇-0.1%冰醋酸,梯度洗脱［3-6］(0 ～9.0 min,45.0%A；9.0 ～19.0 min,45.0%→52.0%A； 19.0 ～26.0 min, 52.0%→59.0%A； 26.0 ～38.0 min, 59.0%→72.0%A；38.0 ～44.0 min, 72.0% →78.0% A； 44.0 ～50.0 min,78.0%→45.0%A)；0 ～19.0 min 时在280 nm［6-9］波长下检测牛蒡子苷和牛蒡子苷元,19.0～38.0 min 时在321 nm［7,10-12］波长下检测迷迭香酸、白花前胡甲素、白花前胡乙素、白花前胡E素,38.0～50.0 min 时在250 nm［7,13］波长下检测五味子醇甲；体积流量1.0 mL/min；柱温25 ℃；进样量10 μL。

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液 精密称取牛蒡子苷、牛蒡子苷元、迷迭香酸、白花前胡甲素、白花前胡乙素、白花前胡E 素、五味子醇甲对照品适量,甲醇分别制成 1.918、 0.882、 0.526、 0.994、 0.266、 0.372、0.418 mg/mL,各精密吸取2.5 mL于同一50 mL 量瓶中,甲醇定容,即得(质量浓度分别为95.9、44.1、26.3、49.7、13.3、18.6、20.9 μg/mL)。

2.2.2 供试品溶液 取胶囊适量,倾出内容物研细,精密称取0.2 g,置于50 mL 量瓶中,加45 mL甲醇超声提取0.5 h,放冷,甲醇稀释至刻度,振摇均匀,滤过,即得。

2.2.3 阴性样品溶液 按胶囊处方和生产工艺要求,分别制备不含牛蒡子、紫苏叶和紫苏子、前胡、五味子的阴性样品,按“2.2.2” 项下方法制备,即得。

2.2.4 线标溶液 精密吸取“2.2.1” 项下贮备液各2.5 mL,置于同一20 mL 量瓶中,甲醇制成线标溶液Ⅰ,精密吸取适量,甲醇分别稀释2、5、10、20、25 倍,分别制成线标溶液Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ,即得。

2.3 方法学考察

2.3.1 系统适用性与专属性试验 精密吸取对照品、供试品、阴性样品溶液适量,在“2.1” 项色谱条件下进样测定,结果见图1。由图可知,各成分均能实现基线分离,阴性无干扰,理论塔板数按所测成分计均大于3 500,分离度均大于1.5。

图1 各成分HPLC 色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.3.2 线性关系考察 精密吸取“2.2.4” 项下线标溶液Ⅰ～Ⅵ适量,在“2.1” 项色谱条件下进样测定。以溶液质量浓度为横坐标(X),峰面积为纵坐标(Y) 进行回归,结果见表1,可知各成分在各自范围内线性关系良好。

表1 各成分线性关系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.3.3 精密度试验 取“2.2.1” 项下对照品溶液,在“2.1” 项色谱条件下进样测定6 次,测得牛蒡子苷、牛蒡子苷元、迷迭香酸、白花前胡甲素、白花前胡乙素、白花前胡E 素、五味子醇甲峰面 积 RSD 分 别 为 0.57%、 0.68%、 0.71%、0.63%、1.01%、0.96%、0.87%,表明仪器精密度良好。

2.3.4 重复性试验 取同一批胶囊 (批号17120812),按“2.2.2” 项下方法制备供试品溶液6 份,在“2.1” 项色谱条件下进样测定,测得牛蒡子苷、牛蒡子苷元、迷迭香酸、白花前胡甲素、白花前胡乙素、白花前胡E 素、五味子醇甲含有 量 RSD 分 别 为 0.96%、 1.08%、 0.79%、1.05%、1.59%、1.47%、1.43%,表明该方法重复性良好。

2.3.5 稳定性试验 取同一份供试品溶液(批号17120812),于0、2、4、8、16、24 h 在 “2.1”项色谱条件下进样测定,测得牛蒡子苷、牛蒡子苷元、迷迭香酸、白花前胡甲素、白花前胡乙素、白花前胡E 素、 五味子醇甲峰面积RSD 分别为0.55%、0.62%、0.73%、0.59%、1.04%、0.92%、0.81%,表明溶液在24 h 内稳定性良好。

2.3.6 加样回收率试验 取含有量已知的同一批胶囊(批号17120812) 适量,倾出内容物,研细,精密称取6 份,每份0.1 g,置于50 mL 量瓶中,分别精密加入牛蒡子苷、牛蒡子苷元、迷迭香酸、白花前胡甲素、白花前胡乙素、白花前胡E 素、五味子醇甲对照品溶液(质量浓度分别为1.327、0.569、0.718、0.751、0.342、0.479、0.611 mg/mL)2.0、 2.0、 1.0、 2.0、 1.0、 1.0、 1.0 mL, 按“2.2.2” 项下方法制备供试品溶液,在“2.1” 项色谱条件下进样测定,计算含有量。结果,牛蒡子苷、牛蒡子苷元、迷迭香酸、白花前胡甲素、白花前胡乙素、白花前胡E 素、五味子醇甲平均加样回 收 率 (RSD) 分 别 为 100.1% (0.76%)、99.28% (0.94%)、 97.90% (1.33%)、 99.74%(0.61%)、96.91% (1.40%)、98.56%(1.25%)、98.69% (1.16%)。

2.4 相对校正因子计算 精密吸取“2.2.4” 项下线标溶液Ⅰ～Ⅵ适量,在“2.1” 项色谱条件下进样测定,以迷迭香酸为内标,计算其他6 种成分相对校正因子f内标/其他成分, 公式为f内标/其他成分＝f内标/f其他成分＝ (W内标×A其他成分) / (W其他成分×A内标) (W为质量浓度,A 为峰面积),结果见表2。

表2 各成分相对校正因子Tab.2 Relative correction factors of various constituents

2.5 耐用性试验 考察Waters 2695、Agilent 1260色谱 仪 和Kromasil C18、 Shim-pack C18、 Hypersil ODS C18色谱柱对相对校正因子的影响,结果见表3,可知均无明显影响。

2.6 色谱峰定位 考察“2.5” 项下仪器和色谱柱对相对保留时间的影响,结果见表4,可知均无明显影响。

表3 不同仪器、色谱柱对相对校正因子的影响Tab.3 Effects of different instruments and columns on relative correction factors

表4 各成分相对保留值Tab.4 Relative retention values of various constituents

2.7 样品含有量测定 取3 批胶囊,按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液,在“2.1” 项色谱条件下进样测定,分别采用外标法和一测多评法计算含有量,结果见表5,可知2 种方法所得结果为明显差异。

表5 各成分含有量测定结果（mg/g）Tab.5 Results of content determination of various constituents（mg/g）

3 讨论与结论

本实验在探索苏黄止咳胶囊供试品溶液制备方法 时, 分 别 对 提 取 溶 剂 (甲 醇［6-8,13］、 50%甲醇［14］、75%乙醇)、 提取方式 (超声提取［6-11,13］、回流提取［6］)、提取时间(20、30、40 min) 进行考察,以各成分提取率为指标。最终确定,供试品溶液制备方法为甲醇超声提取30 min。

本实验建立一测多评法同时测定苏黄止咳胶囊中迷迭香酸、五味子醇甲、牛蒡子苷、牛蒡子苷元、白花前胡甲素、白花前胡乙素、白花前胡E素的含有量,该方法简便准确,重复性好,可有效降低检验成本,为该制剂质量标准建立和控制提供有力的数据支持。