张壮丽, 王纪芬, 汪婉莹, 赵志鸿, 王桂芳, 邹 敏

［1.河南省(郑州大学) 医药科学研究院,河南 郑州450052；2.郑州大学药物研究院,河南 郑州450001］

鱼腥草含有多种活性成分,以挥发油、黄酮为主［1-6］,具有抗菌、抗病毒、抗炎、抗肿瘤、抗过敏、增强机体免疫力、平喘等功效［7］,其挥发油为淡黄色透明液体,难溶于水,易溶于有机溶剂(如乙醇、氯仿等)。虽然关于该成分的研究报道很多,但仍很有必要研发相关制剂以增加其溶解度,掩盖不良味道［8］。

泊洛沙姆407 由聚氧乙烯 (PEO) 单元(70%) 和聚氧-丙烯(PPO) 嵌段(30%) 组成,具有多功能三嵌段组合物PEO100-PPO65-PEO100,由于其安全性、较长的循环周期、生物兼容性而广泛用于制备纳米粒［8］,更重要的是它具有较小的CMC［9］,胶束可利用疏水性的内壳包裹鱼腥草挥发油,而且具有1～100 nm 粒径,可避免网状内皮系统吞噬,被动靶向到达肿瘤部位,从而较好地发挥药效,同时聚合物胶束还可缓慢释放药物［10］。因此,本实验制备鱼腥草挥发油聚合物胶束,以期为相关制剂开发提供参考。

1 材料

鱼腥草挥发油(自制)。7890A 气相色谱仪(美国安捷伦公司)；AR1530 分析天平［梅特勒-托利多仪器(上海) 有限公司］；超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；RE-52AA 旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)；WD-2A 药物稳定检查仪(北京同德创业科技有限公司)；ZS90 纳米粒度电位分析仪(英国马尔文仪器有限公司)；JEM 2100 高分辨透射电子显微镜(日本电子株式会社)。甲基正壬酮(中国食品药品检定研究院)；泊洛沙姆407(德国巴斯夫公司)；正己烷(天津市科密欧化学试剂有限公司)。

2 方法与结果

2.1 挥发油提取［11］将干燥的药材全草粉碎成粗粉,然后与蒸馏水以1 ∶10 的比例浸泡10 h,回流10 h,即得。

2.2 GC 条件 HP-5MS 石英毛细管色谱柱；载气氦气,尾吹气氮气；进样口温度280 ℃,氢火焰离子化检测器温度 280 ℃； 空气体积流量450 mL/min,H2体积流量40 mL/min,柱体积流量1 mL/min；进样量1 μL；分流比20 ∶1；程序升温：70 ℃保持5 min,5 ℃/min 升至100 ℃,2 ℃/min升至123 ℃并保持3 min,30 ℃/min 升至280 ℃并保持10 min。

2.3 含有量测定 由于鱼腥草挥发油中甲基正壬酮含有量较高,性质较稳定,故本实验以其为含有量测定指标［12］。

2.3.1 溶液制备

2.3.1.1 对照品溶液 精密称取甲基正壬酮对照品适量,置于25 mL 棕色量瓶中,正己烷溶解并定容至刻度,混匀,封口膜封口,即得,4 ℃下密封保存,临用前稀释成所需浓度。

2.3.1.2 供试品溶液 量取挥发油胶束溶液适量,置于锥形瓶中,加5 mL 正己烷超声提取2 次,第1 次15 min, 第2 次20 min, 转移到量瓶中,0.45 μm微孔滤膜过滤,即得。

2.3.2 专属性考察 制备空白胶束、挥发油胶束溶液,将两者和对照品溶液 (甲基正壬酮) 在“2.2” 项色谱条件下进样测定,结果见图1,可知该方法专属性良好。

2.3.3 精密度试验 制备350、150、10 μg/mL 对照品溶液,在“2.2” 项色谱条件下进样测定,1 d内间隔相同时间进样5 次,测定日内精密度；5 d内每天在相同时间进样1 次,测定日间精密度。结果,3 种质量浓度下前者RSD 分别为1.13%、0.84%、2.15%,后者RSD 分别为0.75%、1.30%、1.27%,表明该方法精密度良好。

2.3.4 稳定性试验 稳定性试验 量取“2.3.1”项下供试品溶液,2 d 内每个时间段分别间隔0、3.5、4、4、12 h 在“2.2” 项GC 条件下进样测定,测得RSD 为2.46%,表明溶液在23.5 h 内稳定性良好。

2.3.5 线性关系考察 分别精密移取对照品溶液1 415、1 101、786、235、157、78、31、15 μL 于10 mL 量瓶中,正己烷定容至刻度,稀释成450、350、 250、 150、 50、 25、 10、 5 μg/mL, 在“2.2” 项色谱条件下进样测定。以溶液质量浓度为横坐标(X),峰面积为纵坐标(Y) 进行回归,得方程为Y＝73 176X-101 784(R2＝0.999 9),在4.767 0～449.687 0 μg/mL 范围内线性关系良好。

2.3.6 检测限、定量限测定 配制1、3、5、7、9 μg/mL 对照品溶液, 以S/N ＝10 为定量限,S/N＝3 为检测限, 测得两者分别为6.689 8、2.867 0 μg/mL。

图1 甲基正壬酮GC 色谱图Fig.1 GC chromatograms of 2-undecanone

2.3.7 加样回收率试验 供试品溶液中加入相当于挥发油含有量80%、100%、120%的对照品溶液,平行3 份,在“2.2” 项色谱条件下进样测定,计算回收率。结果,3 种质量浓度下平均加样回收率分别为98.60%、101.21%、101.92%,RSD分别为1.76%、2.98%、1.75%。

2.4 聚合物胶束制备 称取适量泊洛沙姆407 于圆底烧瓶中, 加入10 μL 挥发油, 氯仿溶解,35 ℃下旋蒸除去有机溶剂,一定体积蒸馏水水化,0.45 μm 滤膜过滤除去未被包裹的挥发油,得到有乳光透明的胶束溶液。精密量取适量于小锥形瓶中,加5 mL 正己烷超声破乳15 min,分液漏斗内静置分层, 取上层于10 mL 量瓶中, 下层再加5 mL正己烷超声破乳20 min,取上层于同一量瓶中,摇匀,0.45 μm 微孔滤膜过滤,取滤液,在“2.2” 项色谱条件下进样测定,按“2.3.5” 项下回归方程计算含有量,并测定包封率和载药量,公式如下。

2.5 Box-Behnken 响应面法

2.5.1 试验设计 在单因素试验基础上,以挥发油与泊洛沙姆407 比例 (A)、 有机溶剂用量(B)、水化体积(C) 为影响因素,包封率(Y)为评价指标,进行3 因素3 水平设计。因素水平见表1,结果见表2。

表1 因素水平Tab.1 Factors and levels

2.5.2 方差分析 线性分析,Y＝0.740 5+0.007 1A-0.005 1B+0.082 8,R2＝0.303；线性+双因子交互作用分析, Y ＝0.740 5+0.007 1A-0.005 1B+0.082 8C-0.062 2AB+0.029 7AC+0.032 7BC,R2＝0.430 6；线性+平方分析,Y ＝0.897 7+0.007 1A-0.005 1B+0.082 8C-0.129 7A2-0.060 2B2-0.104 7C2, R2＝0.864 2； 二 项 式 拟 合, Y ＝0.897 7+0.007 12A-0.005 14B+0.082 76C-0.129 72A2-0.060 20B2-0.104 75C2-0.062 20AB+0.029 70AC+0.032 72BC,R2＝0.991 7。

表2 试验设计及结果Tab.2 Design and results of tests

由此可知,二项式拟合模型相关系数最大,故选择其进行后续研究(α ＝0.05),方差分析见表3。由表可知,R2＝99.17%,调整R2＝97.67%,表明该模型可解释97.67%包封率的变化；除因素A、B 外对包封率均有显著影响(P＜0.05)；失拟项P ＝0.406＞0.05,表明其他未知因素对实验干扰小,能较好地模拟实际情况。

表3 方差分析Tab.3 Analysis of variance

2.5.3 响应面分析 见图2。

图2 各因素响应面图Fig.2 Response surface plots for various factors

2.5.4 验证试验 由图2 可知,最优工艺为挥发油与泊洛沙姆407 比例1 ∶3,有机溶剂用量5 mL,水化体积5.4 mL,包封率91.48%。再平行制备3批聚合物胶束, 测得其包封率分别为87.5%、88.7%、85.6%, 平均87.26% (RSD ＝1.79%),载药量为3.68%,与预测值相当。

2.6 表征

2.6.1 形态 将聚合物胶束溶液滴到铜网上,

2.0 %磷钨酸染色,自然晾干后透射电镜(TEM)观察,结果见图3。由图可知,聚合物胶束无粘连,粒径与马尔文粒径仪测定的一致。

2.6.2 粒径、PDI、Zeta 电位 图4 显示,聚合物胶束平均粒径为35.20 nm,PDI 为0.158,而且分布均匀,有明显的乳光现象。另外,其Zeta 电位在-7.51 mV 左右,峰宽度为6.88,体系较稳定。

图3 样品TEM 图Fig.3 TEM image for samples

图4 样品粒径图Fig.4 Particle size diagram for samples

2.6.3 外貌 泊洛沙姆407 直接溶于蒸馏水中,标记为1 号；直接溶解法、薄膜分散法制备聚合物胶束,分别标记为2、3 号。肉眼观察发现,1 号不存在乳光澄清透明现象,3 号存在明显乳光现象,并且比2 号更明显。

2.6.4 体外释放行为 吸取薄膜分散法、直接溶解法制备的聚合物胶束溶液各5 mL,分别装入不同的1 000 Da 透析袋内,释放介质均为含10%无水乙醇的磷酸盐缓冲液 (总体积30 mL)［13］,37 ℃下120 r/min 摇床振荡,于0.5、1、2、4、6、8、12、24、36、48、72 h 各吸取3 mL,并加入新鲜的3 mL 释放介质,按“2.4” 项下方法测定含有量,计算累积释放度,结果见图5。由图可知,薄膜分散法制备的聚合物胶束更具有缓释作用,可能是它被包裹在胶束内壳中,而直接溶解法制备的附在载体表面。

2.7 稳定性评价

图5 样品体外释放曲线Fig.5 In vitro release curves for samples

2.7.1 强光照与高温 按“2.5.4” 项下优化工艺制备1 份聚合物胶束,平均分成3 份,密封于透明西林瓶中,设置光照强度为3 000 lx,药物稳定性检查仪排气扇打开,分别在第0、5、10 天测得包封率为88.6%、63.7%、30.4%。光照实验结束后再制备1 批,平均分成3 份,密封于透明西林瓶中,放到已调好的药物稳定性检查仪中,安装保温挡板(温度设定为60 ℃),分别在第0、5、10 天测得包封率为87.37%、71.82%、60.58%。由此可知,强光照下粒径、Zeta 电位变化不明显,但包封率明显下降,可能与挥发油中甲基正壬酮在该条件下不稳定有关；高温下聚合物胶束发生粘连,粒径变大,PDI 先降低后增大,外观澄清透明,乳光逐渐消失,推测其可能已被破坏。

2.7.2 4 ℃与室温 制备1 份聚合物胶束,平均分成6 份,室温下放置；再取6 份,4 ℃下放置,于第0、5、10、30、60、90 天测定包封率、粒径、PDI。结果, 室温下包封率分别为 90.34%、89.21%、 85.78%、 78.64%、 75.31%、 61.62%,状态无明显变化,粒径、PDI 也变化不大；4 ℃下在第60 天出现絮状物,将其超声溶解后继续测定,分 别 为 88.91%、 84.74%、 83.28%、 76.65%、72.84%、73.11%,表明2 种条件下包封率降低程度相当,可能与密封性有关。由于4 ℃下聚合物胶束出现不稳定状态,故它适合在室温下贮存。

3 讨论

本实验以甲基正壬酮为鱼腥草挥发油含有量测定指标,并通过方法学考察发现其精密度、稳定性、加样回收率均较理想。同时,首次通过Box-Behnken 响应面法优化鱼腥草挥发油聚合物胶束制备工艺,验证试验中所测包封率与预测值相当。另外,该制剂粒径均匀,在35 nm 左右,而且分布无粘连。

测定累积释放度时发现,薄膜分散法制备的鱼腥草挥发油聚合物胶束释放速度较直接溶解法制备的缓慢,72 h 时仍有释放,表明此时挥发油均匀分布在胶束的疏水性内壳中,从而达到缓释作用。考察稳定性时发现,聚合物胶束包封率在室温、4 ℃下均有所减少,可能是其密封性不理想所致,但在4 ℃下第60 天出现的絮状物在室温下未出现,可能是该条件下不稳定,或与泊洛沙姆407 性质有关。高温下挥发油挥发性增强,而且泊洛沙姆407易发生粘连；强光照下包封率显著降低,这是由于甲基正壬酮在该条件下不稳定。

综上所述,本实验制备了鱼腥草挥发油聚合物胶束,其粒径小,包封率高,可将挥发油被动靶向到治疗部位,而且能明显增加其溶解度,掩盖其不良气味。采用Box-Behnken 响应面法优化制备工艺,可减少实验时间,降低资源浪费［14］,为后续研究鱼腥草挥发油及相关制剂提供依据。