孟秀杰, 刘媛媛, 胡久丽

(1.唐山职业技术学院,河北 唐山063000；2.承德医学院附属医院药剂科,河北 承德067000)

随着人民生活水平提高和社会节奏加快,心脑血管疾病已成为危害人类的第一杀手,其中心绞痛是由冠状动脉供血不足、心肌急剧暂时缺血缺氧所引起的,以发作性胸痛或胸部不适为主要表现的临床综合征。复方党参片源于国家食品药品监督管理局 标 准 ［编 号 WS-11271 (ZD-1271) -2002-2012Z］［1］,是由党参、丹参、北沙参、当归、金果榄加工而成的中成药复方制剂,具有活血化瘀、益气宁心功效,主要用于心肌缺血所致心绞痛、胸闷等病症的治疗,严善福等［2］发现它对冠心病心绞痛的临床疗效显著,在改善气虚血瘀情况方面优于复方丹参片,但现行质量标准［1］及前期报道［3-5］仅对该制剂中丹参所含的丹酚酸B、丹参酮ⅡA进行定量研究。

中成药复方制剂成分复杂,其疗效往往是多种成分共同作用的结果,单一组分难以全面评价其内在质量,而多组分评价模式已成为发展趋势。因此,本实验建立HPLC 法同时测定复方党参片中君药党参特征成分党参炔苷,臣药丹参代表性成分丹参素、丹酚酸B、丹参酮ⅡA,臣药当归和佐药北沙参主要成分补骨脂素、花椒毒素、佛手苷内酯、欧前胡素、藁本内酯的含有量,为该制剂质量标准提高和完善提供数据支持。

1 材料

Agilent 1100 型高效液相色谱仪(美国Agilent公司)；AE240 型分析天平(十万分之一,瑞士Mettler-Toledo 公司)；KQ-400DB 型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。复方党参片3批(片芯0.32 g,批号170501、171101、180401)购于桂林红会药业有限公司。补骨脂素(110739-201617,含 有 量99.7%)、 丹 酚 酸 B (111562-201716,含有量94.1%)、 欧前胡素 (110826-201616,含有量99.6%) 对照品均购于中国食品药品检定研究院；党参炔苷(136085-37-5,含有量 95.0%)、 丹 参 素 (22681-72-7, 含 有 量98.0%)、丹参酮ⅡA(568-72-9,含有量98.0%)、花椒毒素(298-81-7,含有量98.0%)、佛手苷内酯 (484-20-8, 含 有 量 98.0%)、 藁 本 内 酯(81944-09-4,含有量98.0%) 对照品均购于上海纯优生物科技有限公司。乙腈为色谱纯；其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Hypersil C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)；流动相乙腈-0.1%甲酸,梯度洗脱(0 ～14.5 min,24.0%A；14.5 ～19.0 min,24.0%→30.0%A； 19.0 ～32.5 min, 30.0%→48.0%A；32.5～52.0 min,48.0%→72.0%A；52.0～60.0 min,72.0%→24.0%A)；0～19.0 min 时在269 nm 波长下检测党参炔苷［6-7］,19.0 ～32.5 min 时在280 nm波长下检测丹参素、 丹酚酸B、 丹参酮ⅡA［8-9］,32.5～46.5 min 时在310 nm 波长下检测补骨脂素、花椒毒素、 佛手苷内酯、 欧前胡素［10］,46.5 ～60.0 min 时在323 nm 波长下检测藁本内酯［11］；体积流量0.9 mL/min；柱温30 ℃；进样量10 μL。

2.2 对照品溶液 精密称取各对照品适量,75%甲醇分别制成含党参炔苷4.992 mg/mL、丹参素0.936 mg/mL、丹酚酸B 9.894 mg/mL、丹参酮ⅡA1.482 mg/mL、补骨脂素0.518 mg/mL、花椒毒素1.104 mg/mL、佛手苷内酯0.392 mg/mL、欧前胡素0.276 mg/mL、藁本内酯6.212 mg/mL 的贮备液,各精密吸取2.5 mL 置于50 mL 量瓶中,75%甲醇定容, 即得(质量浓度分别为0.249 6、0.046 8、0.494 7、0.074 1、0.025 9、0.055 2、0.019 6、0.013 8、0.310 6 mg/mL)。

2.3 供试品溶液 取片剂适量,除去糖衣后研成细粉,混匀,精密称取约2.0 g,置于25 mL 具塞锥形瓶中, 精密加入75%甲醇20 mL, 超声(400 W、40 kHz) 提取30 min,放冷,75%甲醇定容至刻度,摇匀,滤过,即得。

2.4 阴性样品溶液 按照片剂质量标准项下的处方和制法,分别制备缺党参、丹参、北沙参、当归的阴性样品,按“2.3” 项下方法制备,即得。

2.5 系统适应性试验 精密吸取对照品、供试品、阴性样品溶液适量,在“2.1” 项色谱条件下进样测定,结果见图1。由图可知,各成分色谱峰峰形对称,与相邻峰分离度均大于1.5,理论塔板数按各成分计均大于3 500。

2.6 方法学考察

2.6.1 线性关系考察 精密吸取“2.2” 项下贮备液适量,75%甲醇稀释20 倍,在“2.1” 项色谱条件下进样测定。以溶液质量浓度为横坐标(X),峰面积为纵坐标(Y) 进行回归,结果见表1,可知各成分在各自范围内线性关系良好。

表1 各成分线性关系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.6.2 精密度试验 精密吸取“2.2” 项下对照品溶液,在“2.1” 项色谱条件下进样测定6 次,测得党参炔苷、丹参素、丹酚酸B、丹参酮ⅡA、补骨脂素、花椒毒素、佛手苷内酯、欧前胡素、藁本内酯峰面积RSD 分别为0.71%、1.10%、0.56%、0.72%、1.04%、0.95%、1.12%、1.25%、0.62%,表明仪器精密度良好。

图1 各成分HPLC 色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.6.3 重复性试验 取同一批片剂6 份, 按“2.3” 项下方法制备供试品溶液,在“2.1” 项色谱条件下进样测定,测得党参炔苷、丹参素、丹酚酸B、丹参酮ⅡA、补骨脂素、花椒毒素、佛手苷内酯、欧前胡素、藁本内酯含有量RSD 分别为1.63%、1.70%、0.47%、1.69%、0.54%、1.71%、1.80%、0.85%、1.55%,表明该方法重复性良好。

2.6.4 稳定性试验 取同一份供试品溶液,于0、2、4、8、12、24 h 在“2.1” 项色谱条件下进样测定,测得党参炔苷、丹参素、丹酚酸B、丹参酮ⅡA、补骨脂素、花椒毒素、佛手苷内酯、欧前胡素、藁本内酯峰面积RSD 分别为0.65%、1.09%、0.60%、0.76%、1.07%、1.01%、1.15%、1.20%、0.66%,表明溶液在24 h 内稳定性良好。

2.6.5 加样回收率试验 取含有量已知的片剂6 份,除去糖衣后研成细粉,混匀,精密称取约1.0 g, 置于25 mL 具塞锥形瓶中, 精密加入0.931 mg/mL 党参炔苷对照品溶液 4.0 mL、0.541 mg/mL 丹参素对照品溶液 1.0 mL、1.431 mg/mL 丹 酚 酸 B 对 照 品 溶 液 5.0 mL、0.962 mg/mL 丹参酮ⅡA对照品溶液1.0 mL、0.329 mg/mL 补骨脂素对照品溶液1.0 mL、0.648 mg/mL 花椒毒素对照品溶液 1.0 mL、0.216 mg/mL 佛手苷内酯对照品溶液1.0 mL、0.155 mg/mL 欧前胡素对照品溶液1.0 mL、0.877 mg/mL藁本内酯对照品溶液5.0 mL, 按“2.3” 项下方法制备供试品溶液,在“2.1” 项色谱条件下进样测定,计算回收率。结果,党参炔苷、丹参素、丹酚酸B、丹参酮ⅡA、补骨脂素、花椒毒素、佛手苷内酯、欧前胡素、藁本内酯平均加样回收率 (RSD) 分别为98.33% (1.12%)、97.70% (0.95%)、 100.23% (0.78%)、 99.45%(1.40%)、98.49% (1.32%)、98.79% (0.84%)、97.86% (1.26%)、 96.97% (1.59%)、 99.12%(0.87%)。

2.7 样品含有量测定 取3 批片剂,按“2.3”项下方法制备供试品溶液,在“2.1” 项色谱条件下进样测定,计算含有量,结果见表2。

表2 各成分含有量测定结果（mg/片，n=3）Tab.2 Results of content determination of various constituents（mg/tablet，n=3）

3 讨论

3.1 供试品溶液制备方法选择 本实验以待测成分提取率为评价指标, 考察了提取溶剂 (甲醇［6,11］、75%甲醇［8,12］、50%甲醇、 乙醇)、 提取方式 (超声提取、回流提取)、提取时间 (15、30、60 min) 对供试品溶液的影响,最终确定其制备方法为75%甲醇超声提取30 min。

3.2 色谱条件选择 本实验以待测成分峰形、分离度、色谱峰基线平稳状况为评价指标,考察了流动相 (乙 腈-水［6,10］、 乙 腈-0.1%甲 酸［7,9］、 乙 腈-0.1%磷酸［4,12］) 对测定结果的影响,最终确定乙腈-0.1%甲酸作为流动相进行梯度洗脱,此时待测成分与其他杂质的分离度符合《中国药典》 要求,而且色谱峰基线平稳,峰形对称。

4 结论

本实验采用HPLC 法同时测定了复方党参片中党参炔苷、丹参素、丹酚酸B、丹参酮ⅡA、补骨脂素、花椒毒素、佛手苷内酯、欧前胡素、藁本内酯的含有量,该方法准确度高,重复性好,可用于该制剂质量标准的提高和完善。