张颖慧，岳 华,2，汤 承,2*，黄建德

(1.西南民族大学生命科学与技术学院，四川成都610041；2.青藏高原动物遗传资源保护与利用教育部重点实验室，四川成都610041；3.金瑞鸿捷(厦门)生物科技有限公司，福建厦门361000)

牛传染性鼻气管炎病毒(Infectious bovine rhinotracheitis virus，IBRV)引起牛流鼻涕、咳嗽、呼吸困难、免疫抑制、结膜炎、脑炎、公牛脓疱性龟头-包皮炎和母牛流产等临床症状[1-3]。血清学调查显示，国内外IBRV感染情况普遍[4]。IBRV长期潜伏于牛神经节中，导致感染牛外表健康但终生带毒，在运输、混群和外界刺激等应激因素下易被激活，从而导致其它易感动物IBRV的暴发[5-6]。OIE和我国均规定需对进出口牛、冻精和牛肉制品进行IBRV检疫[7]。由此可见，制定科学防控和净化IBRV的重要性，而准确快速的检测方法是实施科学防控和净化检疫的必要前提。

目前国内外均有大量关于牛传染性鼻气管炎(Infectious bovine rhinotracheitis，IBR)的诊断方法，主要包括病原学诊断和血清学诊断[6-7]，OIE推荐采用Wang等建立的荧光定量PCR方法检测IBRV[8]。但目前以核酸为基础的检测方法，从核酸提取到报告结果仍需要3 h～4 h，且需要专业技术人员在实验室中进行，难以满足口岸现地检疫的需求。国内外已有基于恒温隔绝式荧光PCR(Insulated isothermal PCR，iiPCR)方法现地检测病原微生物的报道，且该方法所需的核酸检测仪器已经实现小型化，自带电源，便于携带、操作简单[9-10]，可以对病原进行现地快速检测，已广泛用于对虾白斑病病毒、蓝舌病毒、口蹄疫病毒等病原[11-13]的检测，但还未见iiPCR应用于IBRV检测的文献报道。本研究建立了现场检测IBRV的iiPCR方法，实现对IBRV的现地快速准确的检测。

1 材料与方法

1.1 病毒株、菌株和临床样本 IBRV、牛病毒性腹泻-黏膜病病毒(BVDV)、牛副流感3型病毒(BPIV3)、牛呼吸道合胞体病毒(BRSV)、牛腺病毒3型(BAV3)、牛冠状病毒(BCoV)、牛支原体(M.bovis)、多杀性巴氏杆菌(P.multocida)、溶血性曼氏杆菌(M.haemolytica)等的核酸均由西南民族大学动物医学实验室保存，其中BVDV、BPIV3、BRSV和BCoV的核酸均反转录为cDNA保存。

3份IBRV阳性样品为PCR方法[14]检测为阳性，并经测序证实的鼻栻子样本，由西南民族大学动物医学实验室保存；15份鼻拭子样品于2018年9月采集自四川省某牛场，样品采集的牛均表现出流鼻涕、咳嗽、呼吸困难、发热等呼吸道症状，且均于-80℃保存备用。

29份商品化冻精为2017年1月～10月购于某畜牧站，其中7份来自黑龙江，6份来自北京，5份来自上海，5份来自新疆，2份来自河北，1份来自云南，1份来自河南，1份来自四川，1份来自天津，均于-80℃保存备用。

1.2 主 要试剂 Premix ExTaq(Probe qPCR)、pMD19-T载体、DH5α感受态细胞、DNA Marker均购自TaKaRa公司；Gel Extraction Kit和质粒提取试剂盒均购自OMEGA BIO-TEK公司；PetNAD核酸萃取试剂盒、Uni-iiPCR Starter Kit均购自金瑞鸿捷(厦门)生物科技有限公司。

1.3 引物的合成 鉴于OIE推荐的检测IBRV的荧光定量PCR方法的引物和探针能满足iiPCR方法对引物和探针的要求，所以本研究采用该方法的引物和探针[8]，上下游引物分别为gB F：5'-TGTGGACC TAAACCTCACGGT-3'/gB R：5'-GTAGTCGAGCAGA CCCGTGTC-3'；探针为TaqMan Probe：FAM-AGGA CCGCGAGTTCTTGCCGC-TAMRA；扩增片段位于IBRV全基因的57 499 bp～57 575 bp，长度为97 bp，引物和探针由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.4 重组质粒标准品的制备 以IBRV阳性DNA为模板，采用上述引物，PCR扩增预期大小为97 bp的IBRV基因片段，将目的片段回收纯化后克隆至pMD19-T载体，将测序鉴定为阳性的重组质粒作为IBRV阳性标准品，用核酸蛋白质检测仪测定阳性重组质粒标准品的浓度，换算成拷贝数。

1.5 反应体系的优化 按照Uni-iiPCR Starter Kit说明书，利用方阵法，采用50 μL体系对引物的浓度10 μmol/μL(0.5 μL～5 μL)、探针浓度 10 μmol/μL(0.05 μL～0.5 μL)、Taq酶 5 U/μL(1 μL～5 μL)和模板(0.5 μL～5 μL)分别进行优化，以 PCR反应前后的读取到荧光值的增长值最高的用量为最佳，采用优化后的最佳体系作为本研究建立的iiPCR方法的体系。

1.6 特异性试验 采用建立的iiPCR方法对IBRV、BVDV、BPIV3、BRSV、BAV3、BCoV、M.bovis、P.multocida、M.haemolytica核酸进行检测，以ddH2O为模板设立阴性对照，并将iiPCR产物经3.0%琼脂糖凝胶电泳检测，以评价该方法的特异性。

1.7 敏感性试验 将重组质粒标准品做10倍倍比稀释(10-1～10-12)后作为模板，采用建立的iiPCR方法和OIE推荐的荧光定量PCR方法[8]分别对其进行检测，以确定本研究建立的iiPCR方法的检测下限，同时比较两种方法的敏感性。

1.8 重复性试验 采用建立的iiPCR方法对5个稀释度的IBRV重组质粒标准品(10-4～10-8倍稀释)进行检测，每种浓度的模板重复检测3次，检测其批内重复性；同时以这些阳性标准品为模板在不同时间进行3次独立检测，检测其批间重复性。

1.9 临床样本检出情况的比较 采用PetNAD核酸萃取试剂盒提取15份牛鼻拭子的核酸，分别采用建立的iiPCR方法和OIE推荐的荧光定量PCR方法[8]对其进行检测，比较两种方法的检测结果。

1.10 商品化冻精样品检测 采用PetNAD核酸萃取试剂盒分别提取29份商品化冻精的核酸，并采用建立的iiPCR方法重组质粒标准品的鉴定对其进行IBRV检测，并对检测结果进行分析。

2 结果

2.1 iiPCR方法反应体系优化结果 经优化后的iiPCR方法反应体系为：上下游引物各3.5 μL(10 μmol/μL)、探针 0.35 μL(10 μmol/μL)、Taq酶1.25 μL(5 U/μL)、预混 Buffer 25 μL、模板 3 μL、ddH2O 补足至 50 μL。

2.2 特异性试验结果 采用已建立的iiPCR方法检测各病原核酸，结果显示其仅对IBRV核酸可以扩增出目的片段，而对 BVDV、BPIV3、BRSV、BAV3、BCoV、M.bovis、P.multocida、M.haemolytica等均不能扩增出目的片段(图1)，表明该方法特异性较强。

2.3 敏感性试验结果 测定IBRV重组质粒标准品的浓度后换算成拷贝数为2.4×1010拷贝/μL。iiPCR方法敏感性检测结果显示，该方法对IBRV质粒标准品最低检测限为2.4拷贝/μL(图2A)。与OIE推荐的荧光定量PCR方法检测下限一致(图2B)，表明两种检测方法均具有较高的敏感性。

2.4 重复性试验结果 采用建立的iiPCR方法对5个稀释度的IBRV质粒标准品的进行批内和批间重复性试验，结果显示，批内3个平行和批间3次重复的检测结果均一致，证明该方法具有良好的重复性。

2.5 临床样本检出情况的比较 采用建立的iiPCR和OIE推荐的荧光定量PCR方法同时对15份鼻拭子样品进行检测，结果显示两种方法对IBRV的检测结果和阳性率完全一致，均为53%(8/15)，表明建立的iiPCR方法能够满足对IBRV临床样本的现地检测。

2.6 商品化冻精检测结果 采用iiPCR方法对9个省29份商品化冻精的检测结果显示，IBRV的总阳性率为24%(7/29)(表1)。表明我国流通的商品化冻精携带IBRV的情况较普遍。

表1 商品化冻精中IBRV的检测结果

3 讨论

临床IBRV抗体检测为阴性的牛仍可能是IBRV潜伏携带者[15]，因此针对IBRV抗原的检测方法可能对潜伏期的病原更有效。OIE推荐使用荧光定量PCR方法对调运活牛和商品化冻精进行IBRV检测[8,16]，但需要在专业的实验室中进行，且从核酸提取到报告检测结果通常需要3 h～4 h，难以满足运输口岸现地检疫的需求。

iiPCR是一种基于热对流原理的荧光PCR扩增技术[17]，基于该原理研发的手持式POCKIT小型荧光PCR仪仅重380 g，自带电源，无需设置反应条件，一键操作，仅需42 min即可完成PCR反应，且结果直接显示在液晶屏上，容易判读[9-10]，适用于现地快速检测，目前已经在病原快速检测中广泛应用[11-13]。本研究建立的检测IBRV的iiPCR方法特异性和敏感性好，为IBRV的检测提供了一种新的可靠的方法。核酸提取的时间是影响PCR检测结果报告时间的重要因素[10]，传统的酚-氯仿法和DNA提取试剂盒需要高速冷冻离心、水浴和冰浴等环节，只能在实验室中进行，且通常需要40 min～120 min。为配合现地PCR检测的需要，本研究采用了Pet-NAD核酸萃取试剂盒，其提取过程仅需常温低速离心，可以在15 min内完成。并且，本研究建立的iiPCR方法配合核酸提取试剂盒，对临床样本的检测结果与OIE推荐的荧光定量PCR方法是一致的，但从核酸提取到报告检测结果可在1 h内完成，大大节省了检测时间，且操作简单，能够满足对IBRV口岸检疫和现地检测的需要。

种公牛感染IBRV后，存在虽然外表健康但终生带毒的情况，其精液中可以携带IBRV，经自然交配或人工授精使母牛感染，从而导致母牛流产和产奶量下降等[16]。季新成等对新疆某牛场120份新鲜牛精液和40份冻存牛精液进行IBRV检测结果显示，IBRV阳性率为16%[18]；本研究对来自9个省的29份商品化冻精检测结果显示，IBRV阳性率为24%。表明我国流通的商品化冻精携带IBRV较为普遍，有必要加强对我国流通的商品化冻精的监测，同时建议加强对种公牛的检疫净化。