胡皓睿，杨卫民，黄绘，廖明，周晓明

目前研究认为男性不育与吸烟有显著关联[1]。而尼古丁是香烟中毒性最大的化合物，对女性和男性生殖系统均有不良影响[2-3]。多项研究表明，尼古丁可减少睾酮和黄体生成素（Luteinizing hormone，LH）等释放[2，4]。尼古丁通过影响正常形态精子的数量、运动和生存，从而降低男性的生育能力[5]。另外，尼古丁摄入量均与生殖系统细胞凋亡增加相关，且没有性别差异[6]。高抗氧化化合物可有效减少尼古丁作用，褪黑素具有强大的抗氧化活性。男性的褪黑素被睾丸吸收，可调节睾丸活动，也可调节睾丸中细胞生长、有丝分裂和间质细胞的分泌[7]。化疗、糖尿病和高脂血症等因素可影响褪黑素对睾丸的保护作用[8]。目前尼古丁对于男性生殖系统的影响已有较多报道，然而褪黑素对尼古丁处理睾丸的影响尚少见相关报道。本研究旨在评估褪黑素对尼古丁处理大鼠精子发生、精子核完整性和附睾精子参数的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 32 只清洁级雄性SD 大鼠，体质量180～220 g，购自贵州医科大学动物中心（许可证号：SCXK2013-0001）。正常鼠粮饲养，自由饮水和摄食，且每周更换垫料；每日光照12 h，黑暗12 h。采用随机数字表法将大鼠分为4组，每组8 只。A 组为对照组，腹腔注射生理盐水（10 mL/kg）；B 组腹腔注射尼古丁1 mg/kg；C 组腹腔注射褪黑素10 mg/kg；D组腹腔注射尼古丁1 mg/kg+褪黑素10 mg/kg，各组均每日注射1 次，持续30 d。尼古丁在给药前用生理盐水稀释为0.5 g/L。褪黑素使用前先用无水乙醇溶解，然后加生理盐水稀释为5 g/L。

1.1.2 实验仪器和试剂 石蜡切片机（深圳永年科技有限公司）；光学显微镜（日本Olympus公司）；精子质量检测系统（北京伟力新世纪科技发展公司）；褪黑素（上海梯希爱化成工业发展有限公司）；尼古丁酒石酸盐、福尔马林和HE染料（美国Sigma 公司）；低熔点琼脂糖（上海谷研生物科技有限公司）；DNA 完整性检测试剂盒（深圳博锐德生物科技有限公司）；TUNEL 染色试剂盒、睾酮和LH 酶联免疫吸附法（ELISA）试剂盒（武汉博士德生物科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 精子发生分析 所有大鼠在31 d通过颈椎脱位处死，切除睾丸和附睾。右侧睾丸采用10%福尔马林固定，脱水及石蜡包埋。然后制备5 μm切片并进行HE染色，在光学显微镜下评估精子发生情况。通过Johnsen评分法对精子质量和成熟度进行评估[8]。生精细胞包括精原细胞、初级精母细胞、次级精母细胞、精子细胞和精子。观察各组生精小管结构、小管内各级生精细胞数量等变化。连续观察100个生精小管，计算其平均分，评分标准参照文献[9]。

1.2.2 TUNEL染色 右侧睾丸通过10%福尔马林固定，脱水及石蜡包埋，制备5 μm 石蜡切片。按照TUNEL 染色试剂盒说明书检测各组大鼠睾丸上细胞凋亡情况。在光学显微镜下，每只小鼠取20个生精小管横截面进行凋亡细胞计数，取平均数。

1.2.3 ELISA分析 大鼠处死后立即从下腔静脉采血1 mL。静置1 h后离心，分离血清，并置于-80 ℃冰箱中保存。采用ELISA 法检测血清睾酮和LH 水平，严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.2.4 附睾精子参数 取大鼠附睾尾部置于3 mL 37 ℃生理盐水中，剪碎并静置1 min，制成精子混悬液。采用WL-9000型精子质量检测系统检测精子的活力及密度等。采用改良巴氏染色法染色，对精子悬液涂片进行形态学分析[10]。

1.2.5 精子染色质扩散实验 按照精子DNA 完整性检测试剂盒说明书进行操作。取大鼠附睾尾部置于3 mL 37 ℃生理盐水中，剪碎并静置1 min，制成精子混悬液。70 μL 低熔点琼脂糖融化于65～90 ℃水中，在37 ℃下放置3 min，然后加入30 μL 精子溶液，混合均匀。吸取10 μL 配制好的精液置于0.65%琼脂浇制载玻片上，盖上盖玻片，在4 ℃冰箱中放置4 min。去除盖玻片，22 ℃下放入0.08 mol/L HCl 内7 min，然后置于变性液（包括2-巯基乙醇、酸性Tris、钠十二烷基硫酸盐、乙二胺四乙酸和氯化钠）中25 min。标本片用蒸馏水冲洗2次。将混匀好的染液滴加到玻片上，染色5 min。在常规显微镜400 倍镜下观察结果，计数200 个精子，观察精子光晕，有光晕表示精子DNA完整，根据形态分为大、小光晕；无光晕表示精子DNA 断裂。DNA 碎片指数=DNA 断裂精子/全部精子×100%。

1.3 统计学方法 数据分析采用SPSS 21.0 统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析（ANOVA），组间多重比较行Tukey 检验；变量间相关性分析采用Pearson相关。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组生精细胞计数和Johnsen 评分比较 （1）生精细胞计数。与A 组比较，B 组生精细胞计数均明显减少；C 组生精细胞计数与A 组差异无统计学意义；D 组次级精母细胞、精子细胞个数少于A 组，精原细胞、初级精母细胞和精子个数与A 组差异无统计学意义；C 组和D 组生精细胞计数均多于B 组，C 组与D 组生精细胞计数差异无统计学意义。（2）Johnsen 评分。B 组 Johnsen 评分低于 A 组，C 组和 D组 Johnsen 评分均高于 B 组，C 组与 D 组间差异无统计学意义。见表1。

2.2 各组大鼠生精小管中细胞凋亡情况比较 A、B、C 和D 组大鼠生精小管中凋亡细胞个数分别为5.46±0.43、13.84±0.87、7.26±0.57、7.73±0.46，各组差异有统计学意义（F=287.658，P＜0.05）；B 组较A、C和D 组明显增加（P＜0.05），A、C 和D 组间差异均无统计学意义。凋亡细胞主要见于初级精母细胞和次级精母细胞，见图1。

2.3 各组大鼠LH 和睾酮水平比较 B 组和D 组大鼠血清LH和睾酮水平较A组显著降低（P＜0.05），C组大鼠血清LH 和睾酮水平与A 组差异无统计学意义，但较B组升高（P＜0.05）。D组大鼠血清LH水平与B组和C组差异均无统计学意义；D组睾酮水平高于B 组（P＜0.05），与C 组间差异均无统计学意义。见图2。

2.4 各组大鼠附睾精子参数比较 与A 组比较，B组大鼠附睾精子计数和活力均降低，而异常形态比例升高（P＜0.05）；与B组比较，C组和D组大鼠附睾精子计数和活力均增加，而异常形态降低（P＜0.05）；D组除大鼠附睾精子缓慢前进比例低于C组、不动比例高于C 组外，其余参数与C 组差异均无统计学意义，见表2。

Tab.1 Comparison of germ cell count and Johnsen scores between four groups表1 各组生精细胞计数和Johnsen评分比较 （n=8，±s）

Tab.1 Comparison of germ cell count and Johnsen scores between four groups表1 各组生精细胞计数和Johnsen评分比较 （n=8，±s）

＊P＜0.05；a与A组比较，b与B组比较，P＜0.05

组别A组B组C组D组F生精细胞计数（个）精原细胞11.37±0.54 9.81±0.35a 11.53±0.57b 10.14±0.46b 25.253＊初级精母细胞23.36±0.38 15.02±0.55a 21.53±0.79b 20.15±0.64b 397.911＊次级精母细胞35.26±0.53 18.63±0.68a 33.54±0.97b 27.38±1.03ab 659.061＊精子细胞121.37±0.95 95.57±2.28a 118.54±1.36b 109.73±2.29ab 326.291＊精子83.86±3.17 67.56±1.85a 82.56±1.67b 79.14±2.76b 73.818＊Johnsen评分（分）9.54±0.07 8.36±0.18a 9.34±0.06b 9.06±0.07ab 185.917＊

Fig.1 Immunostaining of seminiferous tubules(TUNEL,×400)图1 生精小管的免疫染色（TUNEL，×400）

Fig.2 Effects of nicotine and melatonin on serum testosterone and LH levels图2 尼古丁和褪黑素对大鼠血清LH和睾酮的影响

Tab.2 Effects of nicotine and melatonin on epididymis sperm parameters表2 尼古丁和褪黑素对附睾精子参数的影响 （n=8，±s）

Tab.2 Effects of nicotine and melatonin on epididymis sperm parameters表2 尼古丁和褪黑素对附睾精子参数的影响 （n=8，±s）

＊P＜0.05；a与A组比较，b与B组比较，c与C组比较，P＜0.05

组别A组B组C组D组F计数（×106/mL）32.53±1.47 23.45±0.76a 33.09±0.87b 29.83±0.81b 150.877＊快速前进（%）10.14±0.16 2.40±0.23a 12.53±0.16b 8.63±0.07b 5 474.09＊缓慢前进（%）38.45±2.17 30.24±2.84a 44.26±2.27b 35.42±2.56bc 44.914＊不动（%）15.13±0.26 30.43±0.45a 10.52±2.47b 18.63±2.96abc 153.115＊总活力（%）63.96±1.25 41.08±1.36a 67.64±1.95b 63.76±2.67b 329.514＊异常形态（%）27.54±1.17 45.54±0.86a 25.86±0.58b 29.65±1.06b 735.802＊

2.5 各组大鼠精子染色质完整性比较 与A 组比较，B组光晕精子比例显著降低，DNA碎片指数显著升高（P＜0.05）。与B 组比较，C 组和D 组光晕精子比例均升高，DNA碎片指数均降低（P＜0.05）。D组光晕精子比例与C 组差异无统计学意义，DNA 碎片指数较C组升高（P＜0.05），见表3。

Tab.3 Effects of nicotine and melatonin on germ cell parameters and sperm chromatin integrity in four groups of rats表3 尼古丁和褪黑素对雄性大鼠精子染色质完整性影响（n=8，±s）

Tab.3 Effects of nicotine and melatonin on germ cell parameters and sperm chromatin integrity in four groups of rats表3 尼古丁和褪黑素对雄性大鼠精子染色质完整性影响（n=8，±s）

＊P＜0.05；a与A组比较，b与B组比较，c与C组比较，P＜0.05

组别A组B组C组D组F光晕精子（%）73.26±1.02 55.87±1.26a 73.64±1.57b 62.51±2.08ab 255.419＊DNA碎片指数（%）12.26±0.54 32.25±0.83a 10.56±0.75b 20.27±0.85bc 1382.947＊

2.6 相关性分析 DNA碎片指数与血清睾酮水平、LH 水平和精子总活力呈负相关（r分别为-0.894、-0.763、-0.786，均P＜0.05），与生殖细胞凋亡、精子异常形态呈正相关（r分别为0.782、0.837，均P＜0.05）。

3 讨论

尼古丁为3α-羟基类固醇脱氢酶抑制剂，在睾酮代谢及前列腺中雄激素变化等方面发挥重要作用[3]。以往研究表明，尼古丁可通过降低精子数量、形态、活力和睾丸质量从而在不孕症中发挥作用[11]。本研究对成年雄性大鼠腹腔注射尼古丁，尼古丁剂量为1 mg/kg，相当于成人每天抽20支烟的血清尼古丁水平[6]。注射30 d后，大鼠精子发生、生殖细胞凋亡、精子参数和精子染色质完整性均发生变化。上述效应的可能原因是，尼古丁可抑制中枢神经系统，从而抑制垂体促性腺激素释放[11]；而垂体促性腺激素变化又会引起睾丸精子发生和类固醇生成改变。

精子发生是一种激素调节过程，特别是睾酮和促性腺激素，如卵泡刺激素和LH[12]。本研究结果显示，尼古丁处理大鼠血清睾酮和LH 水平显著降低。睾酮是精子发生启始及维持的关键激素。LH 是由垂体分泌的，影响睾丸间质细胞并刺激其分泌睾酮。因此，LH水平降低后，睾酮水平也相应降低，本研究结果证实了这一点。另外，本研究结果显示，尼古丁处理后大鼠生精细胞计数均明显减少，生精小管中凋亡细胞个数明显增多，这可能与尼古丁自身毒性以及睾酮和LH水平降低有关；也可能与尼古丁处理后大鼠体内氧化剂，如过氧化氢水平较高有关。目前已经证明，尼古丁可减少睾丸抗氧化水平，并增加睾丸脂质过氧化作用[5]。

另外，本研究对精子染色质完整性进行了评估，以往研究仅通过精子参数评价男性生育状况是不全面的[12]。精子DNA损伤程度与生育率降低相关[12]；而且氧化应激在单链和双链DNA 断裂中发挥重要作用[13]。Condorelli等[14]研究指出，尼古丁通过降低精子染色质DNA完整性使精子活力和数量减少，并呈剂量和时间依赖性。有研究报道，精子活力和精子DNA 损伤也存在显著的负相关[15]。本研究结果显示，尼古丁可使精子形态异常及精子DNA断裂增加；且DNA碎片指数与血清睾酮水平、LH水平和精子总活力呈负相关，与以往研究结果基本一致。

褪黑素是一种主要由松果体和其他器官合成的激素，如视网膜及泪腺。睾丸组织中褪黑素浓度与身体其他组织中类似[12]。研究表明，褪黑素具有抗氧化和捕获自由基的能力[12]。体外研究表明，褪黑素也可改善化疗小鼠精子发生和精子参数[16]，褪黑素处理可提高精液质量[17]。上述研究提示褪黑素对精子具有保护作用。本研究中褪黑素剂量为10 mg/kg，与文献[2]中的剂量相同，结果显示，褪黑素可改善尼古丁处理大鼠精子发生和精子参数，可能与褪黑素的抗凋亡和抗氧化作用有关。褪黑素也可影响下丘脑-垂体-性腺轴和调节性激素分泌，如雌激素、睾酮和LH。本研究中褪黑素也可显著提高睾酮和LH水平，并改善DNA碎片指数，提示可能与褪黑素对睾丸间质细胞的直接作用有关。此外，褪黑素也可改善尼古丁处理大鼠精子染色质完整性，提示精液中褪黑素可能与睾酮和抗氧化酶之间存在关联[18]。

综上所述，褪黑素可通过减少生殖细胞凋亡和调节睾酮水平改善尼古丁处理大鼠精子发生数量、质量和精子染色质完整性，但其具体作用机制有待于进一步研究验证。