马伟涛，夏大胜，夏伟，王丽，卢成志，何强

支架内再狭窄（in-stent restenosis，ISR）是经皮冠状动脉介入治疗（percutaneous coronary intervention，PCI）术后困扰临床的一大难题。尽管已经证实使用药物洗脱支架（drug-eluting stents，DESs）可以抑制内膜增生，降低 ISR 发生率[1]。但DESs 可影响内皮化再生，ISR 的发生率仍高达10%左右[2]。炎症参与动脉粥样硬化的发生与发展，并影响其预后。激活蛋白-1（activator protein-1，AP-1）是一种核转录因子，通过影响细胞因子及其他炎症介质的作用，参与动脉粥样硬化的发生与发展[3]。磷酸化c-jun是其主要活化形式，其数量可反映体内AP-1水平[4]。CD40配体（CD40 ligand，CD40L）在血小板及单核细胞表面表达，促进血小板的黏附及血栓的形成[5]。AP-1 及 CD40L 是体内重要的炎症标志物。组织因子（tissue factor，TF）作为联系炎症与凝血途径之间的桥梁，参与动脉粥样硬化的发生及发展[6]。组织因子途径抑制物（tissue factor pathway inhibitor，TFPI）是 TF 的内源性抑制因子，可特异性地抑制TF介导的血栓形成过程及炎症过程，参与动脉粥样硬化过程。越来越多的证据表明，低度慢性炎症是ISR发病机制中的关键环节[7]。目前有关TF与冠状动脉ISR相关性的研究尚少见。本研究旨在分析PCI术后ISR与炎症标志物c-jun、CD40L及TF、TFPI的关系，并探讨发生ISR的可能影响因素。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选取2015年12月—2017年6月因冠心病就诊于天津市第一中心医院并行PCI的患者200例，其中男161例，女39例，年龄43～78岁，平均（57.12±6.83）岁。经临床症状及冠脉造影明确冠心病诊断，并符合中华医学会2007年冠心病诊断标准并行PCI术。所有研究对象在完全了解本研究并签署知情同意书后方可入组。排除标准：严重感染性疾病、重度心力衰竭、恶性肿瘤、慢性肝肾功能不全、结缔组织疾病。

1.2 一般临床资料收集 收集所有研究对象的一般临床资料，包括性别、年龄、身高、体质量、吸烟史、高血压、糖尿病病史。所有患者均隔夜禁食12 h，于次日清晨7：00采集空腹肘正中静脉血5 mL，以3 000 r/min 离心15 min 后分离血清，置于-80 ℃冰箱中待检。采用德国COBAS MODULAR DPP 全自动生化分析仪测定患者总胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）及高密度脂蛋白胆固醇（HDLC）水平。

1.3 PCI的实施 由临床经验丰富的心内科介入医师操作，采用标准Judkin’s 法经桡动脉或股动脉入路行冠脉造影+PCI 术。记录所用支架的直径及长度。根据改良的Gensini积分评分标准，对每支冠脉血管的病变狭窄程度进行计量评估。Gensini积分计算方法：将冠状动脉分成14段，当冠状动脉狭窄0～25%时权重系数为1，冠状动脉狭窄26%～49%时为2，狭窄50%～74%时为4，狭窄75%～89%时为8，狭窄90%～99%时为16，狭窄100%时为32；根据冠状动脉病变的不同节段确定权重系数，左主干病变为5，前降支近段、回旋支近段为2.5，前降支中段为1.5，右冠状动脉、前降支远段、回旋支远段、左心室后侧支、钝缘支动脉、第1对角支、心尖支为1.0，第2 对角支为0.5。总分为冠状动脉管腔狭窄程度权重系数乘以各病变血管的权重系数之和。

1.4 冠脉ISR的判断与检测 PCI术后规律服用双联抗血小板聚集、调脂等药物治疗。术后1年复查冠脉造影。判断是否发生ISR，并根据判定结果分为ISR组与对照组。冠脉ISR定义：应用冠脉定量测定法测定，支架远端与近端、支架内距支架边缘≤5 mm，支架植入段狭窄程度≥50%。

1.5 磷酸化c-jun、TF、TFPI 指标检测 所有患者于复查冠脉造影时采集空腹肘正中静脉血5 mL，以3 000 r/min 离心15 min 后分离血清，置于-80 ℃冰箱中待检。采用酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）法检测外周血白细胞裂解液中磷酸化c-jun 吸光度（A）值及TF、TFPI 水平，磷酸化c-jun 试剂盒购自美国CST 公司、TF、TFPI试剂盒购自美国ADI公司。严格按照试剂盒说明书操作。

1.6 血小板表面CD40L测定 所有患者于复查冠脉造影时采集肘正中静脉血2 mL，加入含1%的EDTA抗凝试管中，全血检测血小板CD40L。流式抗体FTIC Mouse IgGκ 及FTIC anti-human CD40L 购自美国BD PharMingen 公司，按说明书要求进行操作。取2 支FALCON 管，分别标记（+）和（-），两管均加入标本（E-DTA-K2抗凝静脉血）5 μL。向（-）管中加入FTIC Mouse IgGκ 20 μL，向（+）管中加入FTIC anti-human CD40L 20 μL混匀。室温避光静置30 min。每管加入生理盐水2 mL，混匀，2 000 r/min离心5 min，弃上清。再向每管加入生理盐水1 mL，混匀，通过流式细胞仪统计血小板膜CD40L平均荧光强度。

1.7 统计学方法 采用SPSS 16.0 软件对数据进行统计分析。符合正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示，2组间比较采用独立样本t检验。非正态分布的计量资料以M（P25，P75）表示，2组间比较采用非参数秩和检验。计数资料以例（%）表示，2 组间比较采用χ2检验。符合正态分布的计量资料相关性分析采用Pearson 相关；不符合正态分布的计量资料相关性分析采用Spearman相关。ISR的影响因素采用Logistic回归分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 2 组一般资料比较 PCI 术后1年复查冠脉造影，ISR 组 27 例，对照组 173 例。ISR 组吸烟、糖尿病、Gensini 积分、支架长度、TC 及 LDL-C 水平均高于对照组（P＜0.05）。2组间年龄、性别、体质量指数（BMI）、高血压、支架直径、TG及HDL-C比较差异均无统计学意义，见表1。

2.2 2 组患者磷酸化 c-jun、CD40L、TF、TFPI 及 TF/TFPI 水平的比较 ISR 组磷酸化c-jun、血小板CD40L荧光强度、TF、TFPI及TF/TFPI水平均高于对照组（P＜0.01），见表2。

2.3 ISR 组患者磷酸化 c-jun 与 CD40L、TF 及 TFPI相关性分析 磷酸化c-jun 水平与血小板CD40L 荧光强度、TF及TFPI均呈正相关（rs分别为0.766、0.496、0.540，P＜0.05）。血小板CD40L 荧光强度与TF及TFPI均呈正相关（r分别为0.652、0.702，P＜0.05）。

Tab.1 Comparison of clinical characteristics between two groups表1 2组间一般临床资料的比较

Tab.2 Comparison of the levels of phosphorylated c-Jun，CD40L，TF，TFPI and TF/TFPI between two groups表2 2组患者磷酸化c-jun、CD40L、TF、TFPI及TF/TFPI水平的比较

2.4 ISR 发生的多因素Logistic 回归分析结果 以是否出现ISR（是=1，否=0）为因变量，以年龄、性别（男=1，女=0）、吸烟史（有=1，无=0）、糖尿病史（有=1，无=0）、高血压病史（有=1，无=0）、BMI、TC、TG、LDL-C、HDL-C、支架长度、支架直径、磷酸化c-jun、血小板CD40L荧光强度、TF、TFPI及TF/TFPI水平为自变量，进行多因素Logistic回归分析，结果显示，糖尿病、高TC、高血小板CD40L 荧光强度、高TF/TFPI及植入支架长度较长是发生ISR 的危险因素（P＜0.05），见表3。

Tab.3 Multivariate Logistic regression analysis of ISR表3 ISR发生的多因素Logistic回归分析结果

3 讨论

ISR是影响PCI远期预后的重要因素，其病理生理过程复杂，主要包括受损血管重构、炎症反应和平滑肌细胞增殖迁移3个阶段。血管内皮损伤及炎症反应是ISR 的起始环节，血管平滑肌细胞增殖与迁移、血管新生内膜过度增厚是ISR的中心环节[8]。炎症反应被认为是ISR 的重要机制之一。PCI 术后局部内皮损伤会激活炎症反应，介导血栓形成，造成ISR，同时促进血管平滑肌细胞增殖，加重ISR[9]。目前有关ISR与炎症标志物AP-1、CD40L及TF关系的研究较少。

既往研究表明，AP-1影响丝裂原活化蛋白激酶信号通路，促进平滑肌细胞增殖，促进炎症因子及内皮素-1的释放，在ISR中起重要作用[10]。AP-1可促进其下游通路基质金属蛋白酶- 2（matrix metalloproteinase-2，MMP-2）的表达，而其内源性抑制剂组织金属蛋白酶抑制物-2表达虽代偿性增加，但增加幅度有限，不足以抵消MMP-2 的作用。MMP-2 调节基质降解和平滑肌细胞迁移，从而在ISR 中发挥作用[11]。Buchwald 等[12]研究显示，应用抗AP-1 诱饵寡脱氧核苷酸治疗能显著减小高胆固醇血症小型猪冠状动脉中的新生内膜厚度，提示抗AP-1 结合位点的诱饵寡核苷酸能有效抑制内膜再生，减少ISR 发生率。本研究结果显示，ISR 组血清磷酸化c-jun 水平较对照组升高，而Logistic 回归分析未提示磷酸化c-jun是ISR的影响因素，推测可能与样本量较少或CD40L、TF、TFPI 的相互影响有关，在后续研究中应扩大样本量，并减少各因素的相互影响程度。

CD40L 是肿瘤坏死因子超家族的成员之一，具有趋化因子的活性。CD40L系统广泛分布于血管内皮细胞、平滑肌细胞、巨噬细胞及血小板表面。CD40L 与CD40 结合后通过诱导内皮细胞内细胞黏附分子和TF 参与炎症、血栓形成和动脉粥样硬化，在动脉粥样硬化病变进展和炎症过程中起着重要作用[13]。有研究表明CD40/CD40L 通过诱导细胞因子、趋化因子、生长因子等的表达来使动脉粥样硬化斑块不稳定，并参与多种炎症反应病理生理过程，从而导致ISR 的发生[14]。Yan 等[15]通过间接免疫荧光流式细胞术分析120例PCI患者和20例正常对照者的血小板CD40L水平，PCI术后随访6个月，观察ISR的发生情况。结果显示，发生ISR 者的血小板CD40L 水平明显升高。本研究结果显示，ISR 组CD40L 水平较对照组明显升高，且高CD40L 水平是发生ISR的危险因素，与以往研究结果一致。

TF又称凝血因子Ⅲ，与Ⅶa结合，为外源性凝血途径启动的关键因子。TF/Ⅶa促进单核细胞向巨噬细胞转化，诱导炎症反应，同时通过调控细胞信号转导，促进成纤维细胞、单核细胞的增殖和迁移，参与动脉粥样硬化发生发展[16]。而TFPI 通过与TF-Ⅶa复合物结合，抑制凝血过程。一项旨在探讨TFPI涂层支架在抑制兔颈动脉模型再狭窄中有效性和安全性的研究表明，TFPI包被的支架可以成功地将TFPI基因转染到血管壁细胞中，从而在兔颈动脉模型中抑制再狭窄且未发生明显的不良反应[17]。本研究结果显示，ISR 组 TF、TFPI 及 TF/TFPI 水平较对照组明显升高，提示ISR 患者TF 水平升高，TFPI 水平虽有代偿性升高，但不足以抵消TF 作用。另外，高TF/TFPI 水平是发生ISR 的危险因素。与以往研究相比，明确了TF/TFPI在ISR发生中的作用。本研究中磷酸化c-jun 水平与血小板CD40L 荧光强度、TF 及TFPI 均呈正相关，血小板CD40L 荧光强度与TF 及TFPI呈正相关。有研究表明CD40/CD40L可通过激活体内二酰基甘油—蛋白激酶C信号通路上调炎症因子表达，促进内皮细胞及单核细胞TF 的表达[18]。而CD40L诱导人内皮细胞中TF的表达是通过AP-1介导的[19]。因此，笔者推测 CD40L 是通过 AP-1 介导促进内皮细胞TF表达，参与ISR过程。

综上所述，炎症标志物磷酸化c-jun、CD40L 及TF促进冠心病患者PCI术后ISR的发生。