朱昌丰，曾枝东

广州中医药大学深圳医院(福田)(深圳518034)

甘草又称为国老、甜草，属于多年生草木，是一种补益中草药，药用部位多为根及其根茎，多呈圆柱状，长为25～100 cm，外皮松紧不一，具有清热解毒、祛痰止咳等功效[1]。而甘草油属于临床常用的中药方剂，主要由甘草与香油构成，多用于解毒、润肤、创面清洁等功效[2]。但是，近年来随着临床对于甘草需要的进一步扩大，导致野生资源的甘草难以满足不断增殖的需求，使得人们开始寻找其他方法提高甘草的使用率[3]。国内学者研究表明[4-5]：甘草油主要由甘草组成，而甘草中则含有相对丰富的黄酮类化合物，据欧抗炎、抗氧化、抗肿瘤等多种药理作用，但是临床上对于甘草油的质量标准缺乏研究。因此，加强甘草油的质量标准建立能为临床合理使用甘草油提供依据和参考。本研究将以甘草油为对象，探讨甘草油的质量标准，现报告如下。

资料和方法

1 仪器、设备与试剂 仪器与设备：①高效液相色谱仪(美国科学系统公司)；②色谱工作站。③智能药物检测仪。④纯净水、甘草油(由我院自主研制)、甲醇-水(27∶23)；⑤色谱柱：Kromasil C18柱流动相，色谱纯、硫酸二化钠、硫酸钠，分析纯。试剂：甘草苷对照品(标准品由中国食品药品鉴定研究院提供)、甲醇(美国SPS公司生产、提供，HPLC级)、纯净水、分析纯；购置三种黄精药材，经过鉴定后均为甘草根茎(干燥)。

2 检测方法

2.1 甘草油及甘草苷鉴别:甘草油的鉴别。取甘草油3 g，加入20 ml乙醚，加热后进行30 min回流，去除乙醚液，并向残渣中加入20 ml甲醇，连续进行30 min回流，滤过，将溶液浓缩为4 ml，作为供试品液，以同样方法制备阴性对照液。同时，取甘草苷0.5 g，以相同方法制备对照药材溶液。参考《中药药典》2010年中薄层色谱法吸取3～5 μl上述溶液，分别将其放置在硅胶G薄层板中，晾干后喷浓度为5%三氯化铝乙醇溶液，紫外线下观察(图1)[6]。

注： 1为阴性对照溶液；2～4为供试品溶液；5为对照药材

2.2 甘草苷的鉴别:取甘草苷2 g，加入20 ml乙醚，加热后进行15 min回流，去除乙醚液，并向残渣中加入20 ml甲醇，连续进行30 min回流，滤过，将溶液浓缩为5 ml，作为供试品液，以同样方法制备阴性对照液。同时，取甘草油1.0 g，以相同方法制备对照药材溶液。参考《中药药典》2010年中薄层色谱法吸取3～5 μl上述溶液，分别将其放置在硅胶G薄层板中，晾干后喷浓度为5%三氯化铝乙醇溶液，紫外线下观察(图2)[7]。

3 HPLC法测定甘草油

3.1 色谱条件：色谱柱为Apollo C18；流动相：A

相为乙腈，B 相为 0.1%磷酸水溶液，检测过程中采用梯度洗脱程序进行，见表1。控制流速为1.0 ml/min，波长346 nm，柱温30℃。进样量均为10 μl，见表2。

注： 1为阴性对照溶液；2～4为供试品溶液；5为对照药材

时间(min)乙腈(%)0.1%磷酸水(%)0208054060204060

3.2 对照品溶液制备：精密称取甘草油与甘草苷80 g，将其放置在50 ml量瓶中，采用色谱甲级甲醇将不同的样品完全溶解，并对药物进行定容，混合均匀后完成甘草油220.6 mg/l标准储备液的测定。精密称取甘草油与甘草苷0.1、0.5、1.0、2.5、5.0、10.0 ml，将其分别放置在10 ml量瓶中，获得2.2、11.0、22.1、55.2、110.3及220.6 mg/L的标准溶液(图3)。

3.3 线性关系考察：分别称取对照标准品溶液(0.518 mg/ml)0.3 ml、0.4 ml，将其放置在容量为5 ml的容量瓶中，加入甲醇，稀释，最终获得溶液浓度为31.08%和41.44 μg/ml的对照品溶液；精密吸取0.4 ml、0.518 mg/ml对照品储备液，放入10 ml量瓶中，向量瓶中加入甲醇对溶液进行稀释，直到刻度后混合均匀，加入1 μl待测样品，获得色谱峰面积。回归方程：A=3072078,X-11741，r=0.9993。提示：甘草油中含量在0.1295～0.5180μg，具有良好的线性关系[8-9]。

3.4 精密度试验：分别称取不同甘草油6次，根据上述色谱条件进行重复6次测定，获得峰面积值，RSD分别为：0.43%、0.48%、0.33%、0.55%、0.61%及0.48%，提示：仪器精密度好[10]。

图3 高效液相色谱图

3.5 稳定性考察：分别称取不同甘草油6次，根据上述色谱条件在0、3、6、9、12、15 h进行样，测定峰面积值，RSD分别为0.57%、0.57%、0.46%、0.57%、0.70%、0.51%，提示：样品溶液中甘草油中黄酮含量在15h内具有良好的稳定性。

3.6 重复性试验:分别称取不同甘草油6次，采用供试品溶液制备方法操作，平行制备6份，在上述色谱条件下测定峰面积值，计算平均质量浓度及RSD值。结果分别为：21.8 μg/ml及1.03%、107.1 μg/ml及1.12%、9.5 μg/ml及1.08%、107.1 μg/ml及1.12%、9.5 μg/ml及1.08%、28.3 μg/ml及0.9%、0.5 μg/ml及1.28%和5.2 μg/ml及1.11%。由此看出：该方法具有良好的可重复性。

3.7 回收率试验:分别称取不同甘草油，精密称取0.5 g，分别精密加入5 ml浓度为40 μg/ml 5-HMF对照溶液，并加入甲醇保证溶液整体为25 ml，制备供试品溶液，在色谱条件下完成峰面积的测定，计算甘草油中黄酮含量，平均回收率为97.47%，RSD为2.1%。

3.8 定量限与检测限：选取对照品溶液，根据合适的比例稀释后完成定量限与检测限检测。对于信噪比=10，黄酮含量为1.41 mg/g；对于信噪比=3，黄酮含量为1.39 mg/g。

结 果

1 不同试验次数下甘草油中黄酮含量比较 本研究中对甘草油进行6次测量，在不同选择溶液及参比溶液，将其放置在337 nm部位完成吸光度值A的测定，结果表明：不同吸光度下甘草油中总黄酮含量存在明显的差异，均集中在13.2096～20.0451 mg，平均值为1.81%，见表2。

表2 不同试验次数下甘草油中黄酮含量比较

2 不同试验次数下甘草油中甘草苷及甘草酸水平测定结果比较 精密称取10 μl甘草油放入液相色谱仪中，利用外标法测定甘草油中甘草苷及甘草酸含量，结果表明：不同试验下甘草油中甘草苷与甘草酸含量存在明显的差异性，甘草苷含量主要集中在0.1143～0.3743 mg，甘草酸含量为5.5433～6.3571 mg，见表3。

表3 不同试验次数下甘草油中甘草苷及甘草酸水平测定结果比较

讨 论

甘草是临床上常有的中药材，具有广泛的药用价值，多用于心气虚、心悸怔忡、胃痛、气喘咳嗽等药物，能调和某些药物的烈性，且药物具备类似肾上腺素激素作用[11-12]。而甘草油是临床上常用外用药，处方包括：甘草1两及香油10两，将甘草浸润到香油中24 h，文火将药炸成焦黄，经过去渣后制备得到，药物具有清热解毒、润肤等多种功效。但是，随着我国临床对于甘草需求的日益增大，导致自然甘草量难以满足临床需求。因此，加强甘草油质量标准建立对提高甘草利用率具有重要的意义[13]。

薄层鉴别法是药物质量标准建立中常用的方法，鉴别时将适宜的固定相涂抹在玻璃板、塑料或铝片上，从而形成均匀的薄层，展开后根据比移植与适宜的对照物进行对比，从而完成药品的鉴别、含量的测定。本研究中，对甘草油进行6次测量，在不同选择溶液及参比溶液，将其放置在337nm部位完成吸光度值A的测定，结果表明：不同吸光度下甘草油中总黄酮含量存在明显的差异，均集中在13.2096 g～20.0451 mg，平均值为1.81%。由此看出：甘草油中富含总黄酮，具有抗菌、抗炎、抗肿瘤等效果。但是，本实验中薄层色谱中出现拖尾现象，出现这种现象的原因是多方面的，可能是由于薄层鉴别法使用时硅胶表明具有相对较多的硅胶基，而硅胶基属于亲水性基团，容易与水相互结合，从而形成水合硅胶醇，在一定程度上影响硅胶的活性。同时，温度过高也会引起水与待分离的成分竞争硅醇基，均会引起拖尾，均需要进一步研究与探讨[14]。

为了进一步建立甘草油的质量标准，研究中采用紫外分光光度计完成甘草油中总黄酮测定，通过薄层鉴别法完成甘草油中甘草苷与甘草酸含量测定，结果表明：精密称取10 μl甘草油放入液相色谱仪中，利用外标法测定甘草油中甘草苷及甘草酸含量，结果表明：不同试验下甘草油中甘草苷与甘草酸含量存在明显的差异性，甘草苷含量主要集中在0.1143～0.3743 mg，甘草酸含量为5.5433～6.3571 mg。由此看出：甘草油中含有相对较多的甘草酸及甘草苷，能较高的反应甘草油的药用价值，并且该方法相对简单、易行。但是，紫外分光光度计及薄层鉴别法测定时不同试验次数之间存在明显的差异性，出现这种现象原因是多方面的，可能与测定的时间、药物的类型、产地及采集时间不同有关。同时甘草油不同的生产厂家、标准不同均会对总黄酮、甘草苷及甘草酸含量均会产生影响。因此，临床上急需制定确切的质量标准，进一步规范甘草油中总黄酮、甘草苷及甘草酸含量，避免甘草的浪费，进一步提高甘草药物剂量，在满足临床治疗需要的前提下尽可能减少甘草剂量[15]。

综上所述，本研究起草的甘草油质量标准更加贴近我国现状，具有操作简单、方法准确、可靠等优点，具备良好的专属性、准确性，能有效的控制甘草油药材质量，值得推广应用。