徐东英，冯相珍

河南省濮阳市妇幼保健院妇产科(濮阳 457000)

宫颈癌是妇科较常见的一种恶性肿瘤，其主要是因宫颈先产生上皮内瘤变，然后逐渐进展至上皮下基膜的间质，形成宫颈癌[1-2]。宫颈癌发生的因素有多种，主要与早婚、性生活习惯、HPV病毒感染(高危型)及分娩次数有关。宫颈癌早期大多无明显症状，少部分患者可发生阴道分泌物异常或发生阴道接触性出血等。很多患者到晚期才表现为阴道不规则出血或继发症状。有资料显示[3]，中国宫颈癌患者逐年增多，且有年轻化趋势。因此寻求治疗宫颈癌的药物是目前研究的热点。掌叶半夏对宫颈癌有抑制作用，但对其作用机制的研究临床上较少。本研究探讨掌叶半夏有效提取物对宫颈癌大鼠癌组织中Survivin、Caspase-3、及Caspase-7的影响，以为临床治疗提供新的靶点。

材料和方法

1 材 料 Wistar 大鼠50只，雌性SPF级，6周龄，平均体重(151.2±13.4)g，由上海中科院实验动物中心提供，合格证号为：SCXK(沪)2014-0002；掌叶半夏提取物由上海中科院药物所提供，由美国Sigma公司生产的二甲基亚砜溶解，并用生理盐水(无菌)稀释，现用现配；人宫颈癌Hela细胞株由中国医学科学院研究所提供；DAB显色剂、兔抗人兔抗人Survivin抗体、兔抗Caspase-7 抗体、Caspase-3抗体均由Cell Signalling Technology公司提供。

2 实验方法

2.1 建立宫颈癌大鼠模型:50只大鼠中随机抽取10只作为对照组，其余40只进行造模(根据赵亚丽制造宫颈癌模型的方法)[4]。取人宫颈癌Hela细胞(在无菌操作下)放置于RPMI-1640培养液(由2%谷氨酸钠与10的胎牛血清组成)中，培养环境：温度37℃，5%的体积分数、CO2饱和湿度下培养24 h，用胰酶消化细胞(0.25%)、体积分数是10%的小牛清培养基进行终止消化。离心以1200 r/min的速度，10 min，洗涤后将细胞计数调整至107/ml，用无菌针管抽人宫颈癌Hela细胞的混悬液，并在大鼠腋窝处进行皮下注射(0.5 ml)，常规饲养7 d，有肿瘤结节生长，证明造模成功(共36只)，将造模未成功的4只大鼠剔除。

2.2 分组及用药:将造模成功的36只大鼠随机分为三组(n=12)，各组(包括对照组)均给予纯净水及混合饲料饲养，自行饮食。模型组未进行任何治疗，阳性对照组进行顺铂2 mg/kg腹腔注射，观察组使用掌叶半夏有效提取物40 mg/kg灌胃，均1次/d，连续使用8周。

2.3 肿瘤体积测量:用药8周后，将大鼠处死，取宫颈癌病灶，测量其长、宽、高，计算出其体积。Survivin、Caspase-3及Caspase-7蛋白表达检测:用Western blot法。将各组大鼠处死，模型组、阳性对照组、观察组取肿瘤组织50 g，对照组取腋下皮下组织50 g，置入PBS缓冲液洗涤后，经研磨及离心，用PBS(冰冷)洗涤细胞3次，放入裂解液并摇匀，再置于水中(4℃)冰浴30 min，离心(1200 r/min)10 min，取上清即得胞质蛋白。然后进行蛋白定量分析(用BCA法)。样品蛋白量调整至30 μg～40 g，进行分离(SDS-PAGE凝胶电泳)，并将蛋白质转至PVDF膜。PBST洗膜5 min，并用其溶解后封闭PVDF膜2 h，分别滴加兔抗人Survivin抗体、兔抗人Caspase-3抗体、兔抗人caspase-7抗体(比例均为1∶100)，在温度为4℃环境下静置12 h，然后用PBST再洗涤3次，10 min/次，随后加入二抗，在室温下孵育2 h，用PBST洗涤3次，10 min/次。用ECL将PVDF膜显色，进行X线曝光，以凝胶成像系统进行结果读取与分析。

结 果

1 各组肿瘤病灶体积分析 与模型组比较，观察组及阳性对照组长、宽、高、体积均明显降低(P<0.01)；观察组长、宽、高、体积与阳性对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 各组肿瘤病灶体积分析

注：与模型组比较，*P<0.01

2 Survivin、Caspase-3及Caspase-7蛋白表达 模型对照组 Survivin、Caspase-3及Caspase-7蛋白表达与对照组比较，差异均有统计学意义(P<0.05)；观察组与模型组比较，Survivin蛋白表达明显降低，Caspase-3及Caspase-7蛋白表达明显升高(P<0.05)；观察组 Survivin、Caspase-3及Caspase-7蛋白表达与阳性对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

3 癌病灶体积与相关凋亡蛋白之间的相关性 由Pearson性分析可知，癌病灶体积随Survivin蛋白表达升高而增大，呈正相关(r=0.821，P<0.01)；癌病灶体积与Caspase-3及Caspase-7蛋白表达呈负相关(r分别为-0.876、-0.901，P均<0.01)。

表2 Survivin、Caspase-3及Caspase-7蛋白表达

注：与对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，△P<0.05

讨 论

宫颈癌在妇科属于最常见的恶性肿瘤，其主要因宫颈上皮发生内瘤变而致。对于宫颈癌ⅡA期前(包括ⅡA期，根据FIGO分期)的患者大多主张手术结合放化疗进行治疗，并取得了良好效果。研究证明[5-6]，恶性肿瘤发生与发展一方面与细胞增殖关系密切，另一方面与细胞凋亡明显减少也密切相关。凋亡细胞的作用主要是诱导细胞凋亡，使细胞的增殖与细胞的凋亡一直处于平衡状态，当细胞凋亡抑制因子表达明显升高、细胞凋亡促进因子表达明显降低时，细胞增殖与凋亡间的平衡就容易被破坏，出现细胞无限的增殖与生长，最终发生肿瘤。所以，提高肿瘤组织中凋亡促进因子、下调其凋亡抑制因子，恢复增殖与凋亡间的平衡对恶性肿瘤的治疗意义重大。

Survivin属于一种细胞凋亡抑制因子，其主要作用是阻滞凋亡促进因子酶原向活性凋亡促性因子转化，从而使细胞凋亡受到抑制。其在健康人体组织中一般表达甚低，在恶性肿瘤组织中则呈高表达，其在肿瘤发生发展中有很重要的作用。张明发等[7]的研究中显示，Survivin在正常人体中呈低表达，在宫颈CIN组织中呈现中等表达，在宫颈癌组织中则呈现高表达。也有研究[8]将Survivin表达视为恶性肿瘤辅助诊断及判定预后的重要指标之一。Caspase-3及Caspase-7均为Caspase家族的成员，以诱导细胞凋亡为主要作用。人体中大多细胞的凋亡离不开细胞凋亡因子的诱导，若凋亡促进因子受到抑制，则细胞增殖与细胞凋亡间会失去平衡，导致肿瘤形成。当下调Survivin(凋亡抑制因子)表达时，Caspase(凋亡促进因子)则明显上调，从而加快了细胞的凋亡。

掌叶半夏在科属分类上属天南星科，以块茎入药。最早在20世纪70年代由复旦大学的附属医院将掌叶半夏治疗宫颈癌，结果显示其在宫颈癌抑制方面效果显著，且无发生毒性作用及不良反应。接着又进一步研究其作用机制，结果显示，掌叶半夏能够使抑癌基因P53上调、使癌基因E6表达下调，从而促进细胞凋亡，发挥抗肿瘤作用。细胞凋亡因子有多种，本研究探讨掌叶半夏对细胞凋亡因子Survivin、Caspase-3及Caspase-7的影响[9]。在本研究中，模型组癌组织中Survivin表达明显高于对照组，Caspase-3及Caspase-7表达明显低于对照组，这说明这些相关细胞凋亡因子在肿瘤发生中起着重要的作用。而使用掌叶半夏的观察组能明显降低Survivin表达，升高Caspase-3及Caspase-7表达，从而使肿瘤细胞过度增殖阻断，癌病灶生长延缓或停止，最终导致肿瘤体积缩小，发挥抗肿瘤作用。从本研究结果看，Survivin表达与癌病灶体积呈正相关，与Caspase-3及Caspase-7表达呈负相关，此结果与高艳[10]的研究一致。

综上所述，掌叶半夏有效提取物能使宫颈癌大鼠病灶的体积缩小，其作用机制可能与降低癌组织Survivin表达、升高Caspase-3、Caspase-7表达等细胞凋亡蛋白有关。