惠建荣，张 瑞

1.陕西中医药大学(咸阳712046)；2.陕西中医药大学附属医院 (咸阳712083)

目前，脑卒中已经成为世界各国的常见和多发疾病，对全人类的健康和生命产生了巨大的威胁，其发病特点可概括为“四高一多”(高发病率、高致残率、高死亡率、高复发率、并发症多)[1-4]，它与心脏病、恶性肿瘤成为了导致人类死亡的三大主要因素。缺血性和出血性是脑卒中的两大主要类型，目前缺血性脑卒中在临床上较为多见，约占全部脑卒中的2/3[5-6]。目前，Notch信号通路在中枢神经系统疾病的发生、发展中的研究已受到广泛关注。其中Notch信号通路参与脑缺血后神经功能恢复机制的研究正日益受到重视，前期已有研究表明Notch信号转导通路对缺血性脑损伤后源性神经元的增殖和分化发挥关键调控作用，因而备受关注。

本次实验中，在“少阳主枢”的理论基础上提出利枢针刺法，选取少阳经的穴位外关、阳陵泉，并从行为学、细胞及分子学等方面观察利枢针刺法对模型大鼠Notch信号通路Jagged1蛋白表达的影响及作用机制，从而探讨利枢针刺法是否可通过激活Notch信号通路，促进内源性神经干细胞的增殖、分化及脑缺血后受损神经元的再生，以揭示利枢针刺法在脑缺血治疗中的作用机理，为现代医学治疗脑缺血提供新的思路及方法。

材料和方法

1 实验动物 选取健康雄性SD大鼠60只，体重200～250 g，实验动物合格证号：SCXK(陕) 2012-003，由西安交通大学医学院实验动物中心提供。

2 主要仪器、试剂及药物 电子天平(上海，型号：FA2004A)、电热恒温水槽(上海，型号：DK-8AD)、台式离心机(湖南，型号：TL-4)、内切式匀浆机(宁波，型号：XHF-D)、全自动酶标仪(美国，型号：EON)；兔抗鼠Jagged1多克隆抗体、β-actin、HRP-山羊抗兔IgG、RIpA裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒、蛋白预染 marker均购置于武汉博士德生物有限公司，胞二磷胆碱购置于齐鲁有限公司。

3 动物分组及干预方法

3.1 大脑中动脉阻塞(Middle cerebral artry occlusion，MCAO)造模及分组：造模前大鼠适应性喂养1周。术前均禁食12 h，后选取10只大鼠只游离颈总动脉、颈外动脉，颈内动脉作为假手术对照组，剩余50只大鼠参照Zea-Longa等[7]的方法以线栓法制作MCAO局灶性脑缺血模型。将麻醉大鼠仰卧位固定，用手术刀在颈部正中切口，沿右侧颈部肌肉及筋膜分离出右侧颈部动脉(颈内、颈外、颈总)，把颈外动脉结扎后于近心端将颈总动脉结扎，并将颈内动脉用微动脉夹夹闭。用剪刀在颈总动脉分叉约3 mm处剪一小口，将制备好的鱼线插入颈内动脉，将拴线缓慢推进，插入深度约在18 mm时将微动脉血管夹取下，在切口稍上方部位结扎，消毒，缝合切口，MCAO模型即完成。后将模型制备成功大鼠随机分为模型对照组、利枢机针刺组、普通针刺组、西药灌胃组。

3.2 干预方法：假手术组、模型对照组每日抓拿1次，常规消毒外关、阳陵泉2个穴位；利枢针刺组，针刺外关、阳陵泉，穴位定位参照《实验针灸学》[8]并结合人体同身寸取穴法；普通针刺组，针刺百会、大椎(按高等针灸学教材7版取穴)；西药灌胃组给予胞二磷胆碱0.4 g/kg用生理盐水稀释至2 ml灌胃。

针刺方法：穴位常规消毒后，选用0.5寸毫针刺入，其中外关直刺2 mm，阳陵泉直刺6 mm，百会向前斜刺2 mm，大椎直刺5 mm，留针时间15 min，留针期间施平补平泻手法1次。各组治疗以24 h为1个周期，1次/d，连续治疗14 d。

4 观察指标及方法

4.1 神经功能缺损评分：参照Zea-Longa[7]的评分标准，分别于造模后的1、3、7及14 d对模型大鼠进行评分。4分：不能自发行走，昏睡、意识丧失、痉挛；3分：行走时向左侧倾倒；2分：行走时向左侧转圈；1分：无法完全伸展左侧前肢；0分：无神经缺损症状。除假手术组外，术后1 d神经功能评分在1～3分表示造模成功，0分和4分表示造模失败，予以剔除。

4.2 脑梗死体积百分比的测定：干预结束后，各组各选大鼠5只，麻醉后灌注取脑，于-20℃冰箱冰冻约15 min后进行冠状切片(每片约2 mm)，将切好的脑片置于1%的TTC(取1 gTTC粉末，用PBS充分溶解后定容到10 ml)溶液中，在37℃恒温孵育箱内放置20 min，使之均匀染色。之后用4%的多聚甲醛进行固定，在低温下(4℃)固定24 h后用数码相机进行拍照，无梗死区域为粉红色，有梗死区域则为白色。采用Adobe photoshop7.0图像处理软件测定每一片脑组织的梗死面积，根据相应公式[校正脑梗死体积百分比=(对侧脑组织体积-缺血侧正常脑组织体积)÷对侧脑组织体积×100%]计算梗死面积。

4.3 Jagged1蛋白表达测定:采用WB(Western blotting)测定Jagged1蛋白的表达，将各组剩余的5只大鼠，于干预结束后取右侧大脑海马，提取总蛋白后采用BCA法测定蛋白浓度。变性后取40 μg电泳分离，转移到PVDF膜上，室温封闭1 h，加入兔抗鼠Jagged1多克隆抗体，4℃封闭过夜。第二天从4℃取出膜，洗膜3次，每次10 min，后加入HRP标记的二抗(1∶5000)，室温轻摇1 h，洗膜3次，每次10 min，后用ECL显影，于暗室中感光，定影后利用凝胶自动分析成像软件分析结果，以β-actin为内参照，对结果进行分析。

5 统计学方法 采用SPSS19.0 统计学软件统计分析，检测数据采用均数±标准差表示，作单因素方差分析和t检验，以P<0.05为差异具有统计学意义。

结 果

1 各组大鼠神经功能缺损评分比较 各组大鼠术后1、3、7及14 d神经功能缺失计分及其比较，神经功能评分统计学结果显示：假手术组无神经功能的缺失，其他各组神经功能的评分在术后1、3 d下降无明显差异，术后7、14 d下降比较明显，利枢针刺组及普通针刺组在治疗第14天后的神经功能评分显著低于模型对照组、西药灌胃组，有显著性差异(P<0.01)；且利枢针刺组与普通针刺组比较也存在统计学差异(P<0.05)(图1)。

2 TTC染色结果 各组模型大鼠脑组织经TTC染色可见：假手术组的脑片全部红染，无苍白梗死灶形成，模型对照组、利枢针刺组、普通针刺组、西药灌胃组大鼠的脑组织出现苍白的梗死灶，提示造模成功。四组与假手术组对比(P<0.01)，差异显著；利枢针刺组、普通针刺组、西药灌胃组三组分别与模型对照组比较(P<0.01)，具有显著差异；利枢针刺组、普通针刺组分别于与西药灌胃组对比(P<0.01)，差异有显著性；将两个针刺组进行对比(P<0.01)，有明显差异。术后14 d，分别对各组大鼠的脑组织进行TTC染色，染色图片(图2)，梗死体积百分比结果(图3)。

3 各组大鼠Jagged1蛋白的表达 对缺血性模型大鼠治疗14 d后，经Western blot检测后，各组Jagged1的表达结果显示，各组治疗14 d后Jagged1的表达，余四组与假手术组相对比，Jagged1的表达均增多，其中模型对照组与之存在统计学差异(P<0.05)，利枢针刺组、普通针刺组、西药灌胃组分别与假手术组对比(P<0.01)，差异有统计学意义；将利枢针刺组、普通针刺组、西药灌胃组分别与模型对照组对比(P<0.01)，差异仍具有显著性；利枢针刺组、普通针刺组分别与西药灌胃组对比(P<0.01)，差异也十分明显；两个针刺组之间对比也存在统计学意义(P<0.05)(图4、5)。

图1 神经功能缺失评分

图2 各组大鼠脑组织TTC染色

图3 脑梗死体积百分比

图4 Western blot检测Jagged1蛋白的表达

图5 Jagged1蛋白的表达

讨 论

通利枢机针刺法是以“少阳主枢”、“少阳枢机不利”为理论基础的，作为六经之一的少阳，可以协调运转太阳及阳明的功能，对于阴阳的平衡、表里的开阖同样也发挥着重要的作用，故曰“少阳主枢”。调节全身阳气出入、调节人体气机升降、调节人体阴阳的出入则是少阳枢机作用的三个主要方面。只有少阳枢机作用发挥正常的调节作用，使人体气机出入正常，升降自如，开阖有度，机体的生命活动才得以正常进行，协调运转，取少阳经穴以通利枢机，血脉流行正常，则一切中风之象，自可消除。本实验针刺选穴外关与阳陵泉，其中外关穴为手少阳三焦经脉上的络穴，且与足少阳胆经的足临泣通阳维脉，阳维主诸阳，可以调节全身阳经经气，所以取外关能治疗下肢的病证，还能调节全身气血及阳经阳气。阳陵泉不但是足少阳胆经的合穴，也是胆腑的下合穴，总的来说有宣发和疏调之的功效，故一者可以治疗本经病，二者能治疗胆腑的病变，三者还可治疗筋脉麻痹。由于气机升降逆乱是中风发生的关键，故取阳陵泉能调整其升降失衡之气机，同时该穴为八会穴之筋会穴，能柔筋舒筋，通调气血，通痹止痛，常用于中风偏瘫的治疗。

Notch信号通路是一种经典的信号通路，该通路的家族成员结构上具有高度的保守性[9]。Jagged1是表达于血管内皮细胞和平滑肌细胞中的特异性单次细胞跨膜蛋白，它是细胞膜上Notch受体的关键配体。研究表明，Jagged1表达的增加可以促使星形胶质细胞分泌多种神经营养因子，达到修复神经元以及促进其再生的作用，从而使神经元的存活率提高[10]。

本实验为了探讨利枢针刺法对于Notch信号通路中配体Jagged1的表达的影响以及作用机制，从行为学、细胞及分子水平进行了观察，发现利枢针刺法可以改善脑缺血大鼠神经功能缺失评分以及大脑梗死面积，并提示利枢针刺可增加Jagged1的表达，激活Notch信号通路，从而使NSCs更多的向神经元分化以促进大鼠脑缺血后海马区域神经干细胞再生以发挥神经修复作用，从而达到治疗脑缺血的治疗作用。