朱家佳 龙鼎新

(南华大学公共卫生学院，湖南 衡阳 421001)

钙蛋白酶(calpain)是一组保守的特异性依靠钙激活的中性半胱氨酸蛋白酶，其活性主要与细胞内Ca2+浓度有关[1]。在机体的生理过程中，钙蛋白酶发挥着关键作用，其不仅参与蛋白的降解，还参与细胞骨架重构、细胞周期调控与凋亡、自噬、葡萄糖转运、细胞信号转导等正常的生理过程[2-3]。Calpains主要由80KD的大亚基和30KD的小亚基(calpain-s1，capn4)组成[4]。作为调节亚基， CAPNS1是calpain1和calpain2活性所必需的，而且也是细胞凋亡和存活、细胞迁移所必需的[5]。CAPNS1包含结构域Ⅴ和结构域Ⅵ两个结构域。结构域Ⅴ含大量疏水氨基酸和甘氨酸，具疏水作用；而位于C端的结构域Ⅵ与大亚基结构域Ⅳ结构相似，能与Ca2+结合，对维持calpain功能具有重要的作用。

RNA干扰(RNA interference，RNAi)是细胞中靶特异性基因的选择性转录后下调的高度保守的过程[6]。自从发现以来，这种现象已经成为基因沉默的有力工具，RNAi可对细胞中靶特异性基因进行选择性转录后下调[7]。有研究表明[8]，RAN干扰是一种有效抑制基因表达的技术，RNAi已广泛用于基础生物研究和药物开发过程，为治疗遗传性疾病、传染性疾病、癌症等疾病寻找到新的路径。现有研究表明RNAi对基因功能的研究具有重要意义，其已成为基因生物学中阐明基因功能的金标准[6]。本研究旨在构建pYr-Lvsh-CAPNS1-shRAN载体，干扰CAPNS1基因的表达，为研究CAPNS1基因功能，研究calpain在自噬中的作用提供良好的实验平台。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 Hela细胞、大肠杆菌DH5a 和载体pYr-Lvsh(长沙赢润生物技术有限公司)；各限制性内切(Takara公司，日本)；T4DNA 连接酶、dNTP、RevertAidTMReverse Transcriptase、RiboLockTMRNase Inhibitor 和Taq DNA Polymerase(MBI公司，立陶宛)；总RNA提取试剂Trizol、Lip2000(Thermo Fisher Scientific公司，美国)；THUNDERBIRD SYBR®qPCR Mix (TOYOBO公司，日本)；mouse anti-calpain1(Sigma公司，美国)；rabbit anti-calpain2和rabbit anti-CAPNS1(Abcam公司，英国)；Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-AMC (Enzo life sciences公司，美国)。

1.2 shRNA载体构建

1.2.1 shRNA序列选择及设计 针对靶基因人的CAPNS1基因(NM_001749)，根据shRNA靶位点的选择原则，选取CAPNS1基因转录本的CDS区域中进行靶位点设计CAPNS1 shRNA序列。引物：CAPNS1-shRNA1-f：5’-GATCCCCATGTTCCGTGCCTTCAAATCTCGAGATTTGAAGGCA-CGGAACATGGTTTTTG-3’；CAPNS1-shRNA1-r：5’-AATTCAAAAACCATGTTCCGTGCCTTCAAATCTCGAGATTTGAAGGCACGGAACA-TGGG-3’；CAPNS1-shRNA2-f：5’-GATCCC-GCCACAGAACTCATGAACATCTCGAGATGTTC-ATGAGTTCTGTGGCGTTTTTG-3’；CAPN-S1-shRNA2-r：5’-AATTCAAAAACGCCACAGA-ACTCATGAACATCTCGAGATGTTCATGAGTTCTGTGGCGG-3’；CAPNS1-shRNA3-f：5’-GA-TCCGCTGCAG-CTGACTATGTATTCCTCGAG-GAATACATAGTCAGCTGCAGCTTTTTG-3’；C-APNS1-shRNA3-r：5’-AATTCAAAAAG-CTGCAGCTGACTATGTATTCCTCGAGGAA-TAC-ATAGTCAGCTGCAGCG-3’。

1.2.2 shRNA引物退火 将上述shRNA引物用退火Buffer(10mM Tris-HCl pH8.0、50 mM NaCl、1mM EDTA)分别溶解，然后置于沸水中，自然退火。

1.2.3 shRNA载体酶切线性化 将shRNA载体pYr-Lvsh用内切酶BamHI和EcoRI于37 ℃进行双酶切过夜，然后进行琼脂糖凝胶电泳，胶回收试剂盒回收大片段产物。

1.2.4 链接与转化 用T4 DNA Ligase将退火产物与线性化的pYr-Lvsh于4 ℃进行链接，并过夜。将连接产物转化至感受态大肠杆菌DH5a中，涂布于含有抗性Ampr的LB平板，并于37 ℃恒温培养箱培养12～16 h，挑取单菌落，接种于Ampr抗性LB培养液37 ℃培养过夜。

1.2.5 酶切鉴定与测序 挑取多个单克隆，提取质粒。由于pYr-Lvsh原载体上，有一个XhoI酶切位点(CTCGAG)，当外源的shRNA片段成功插入，则会带入一个新的XhoI酶切位点(即Loop环序列)，两个XhoI之间的片段长度约为2.1 K。因此，重组载体可以用XhoI来进行酶切鉴定并用XhoI酶对重组载体进行酶切鉴定。 最终将酶切鉴定正确的克隆送往长沙嬴润生物技术公司作测序鉴定。测序引物为U6-5’ 测序引物：5’-GACTATCATATGCTTACCGT-3’。

1.3 细胞培养及质粒转染 将Hela细胞置于6孔板中，分别转染pLV-shCAPNS1和pLV-shNC组。按照Lip2000转染试剂盒说明进行操作。转染48h后收集细胞，收集细胞前观察各组细胞绿色荧光情况，判断转染效率。

1.4 qPCR检测 各组细胞中CAPNS1 mRNA表达情况 Trizol法提取总RNA，RNA逆转录为cDNA，根据qPCR引物的设计原则，参考GenBank中CAPNS1的mRNA完全序列，设计qPCR引物，选用GAPDH基因作为内参，荧光定量PCR进行扩增，2一△△ Ct法计算各组CAPNS1 mRNA表达量。引物序列见表1。实验设置3个副孔，重复3次实验。

表1 扩增基因的qPCR引物序列和PCR产物大小

1.5 Calpain活性检测 提取对照组细胞和sh-CAPNS1细胞蛋白，BCA检测蛋白浓度。取50 μg蛋白稀释到含有50 μM荧光底物琥珀酰化多肽氨甲基香豆素(Suc-LLVY-AMC)的缓冲液中，37 ℃孵育15 min，激发波长330 nm，发射波长380 nm，荧光分光光度计测定荧光值，实验设置3个副孔，重复3次实验。

1.6 Western blot检测 提取对照组Hela细胞株(NC)和实验组Hela细胞(sh-CALPAIN)的蛋白，BCA检测蛋白浓度。将蛋白样品进行SDS-PAGE 电泳分离，蛋白转至PVDF膜，5%脱脂牛奶封闭2 h，然后分别加入Mouse anti-Calpain1(1∶1 000)、Rabbit anti-Calpain2(1∶1 000)、Rabbit anti-CAPNS1(1∶1 000)、Rabbit anti-Actin(1∶1 000)，4 ℃孵育过夜。吸走一抗，TBST洗3遍，二抗(1∶3 000)37 ℃孵育1 h，TBST洗5遍。最后用凝胶成像系统进行显影检测蛋白表达情况。

1.7 统计学方法 运用SPSS18.0软件进行单因素方差分析，P<0.05差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 酶切鉴定 将pLV-CAPNS-sh质粒进行XhoI酶切鉴定，鉴定结果如图1所示。得到一条约为2.1 kb的片段，与预计的片段大小一致，表明pLV-CAPNS1-sh酶切鉴定正确无误。

注：M：DNA Marker(2K Plus II)；1：pLV-CAPNS1-shRNA1 经XhoI酶切；2：pLV-CAPNS1-shRNA2 经XhoI酶切；3：pLV-CAPNS1-shRNA3 经XhoI酶切。

图1 pLV-CAPNS1-sh酶切鉴定琼脂糖凝胶电泳图

2.2 重组质粒测序分析 将重组质粒送往长沙赢润生物技术公司进行测序并将测序报告与欲获得的shRNA序列进行比对，可知质粒中插入的shRNA序列都是正确的，提示pLV-CAPNS1-sh构建成功，见图2。pLV-CAPNS1-sh质粒图谱见图3。

注：A、B、C分别表示pLV-CAPNS1-shRNA1、pLV-CAPNS1-shRNA2、pLV-CAPNS1-shRNA3质粒测序图。

图2 pLV-CAPNS1-shRNA测序结果

图3 pLV-CAPNS1-sh质粒图谱

2.3 Hela细胞转染及Real-time qPCR检测CAPNS1表达 将对照组质粒和CAPNS1 shRNA质粒分别转染Hela细胞，转染48 h后收集细胞，收集细胞前观察各组细胞绿色荧光情况。转染效率达80%以上，见图4。与对照组相比，CAPNS1 shRNA转染细胞48 h后，CAPNS1 mRNA表达下降，shRNA1、shRNA2、shRNA3组CAPNS1 mRNA表达分别下降了33.1%、36.7%、50.3%，见图5。

注：A：对照质粒组转染Hela细胞；B：pLV-CAPNS1-sh组转染Hela细胞。

图4 荧光显微镜观察转染后细胞(200×)

注：与NC组相比，*P<0.05。

图5 CAPNS1基因沉默后HeLa细胞中CAPNS1 mRNA水平变化

2.4 Calpain 活性变化 Calpain活性检测结果显示，转染pYr-Lvsh-CAPNS1-shRNA3载体后，Hela细胞中calpain活性下降(P<0.05)，这也表明CAPNS1基因的干扰能够降低calpain活性。见图6。

注：与NC组相比，*P<0.05。

图6 pYr-Lvsh-CAPNS1-shRNA3转染细胞后Calpain活性变化

2.5 Western blot 检测CAPNS1、calpain1和calpain2蛋白表达情况 pYr-Lvsh-CAPNS1-shRNA3载体转染细胞后，Hela细胞中CAPNS1蛋白及受CAPNS1调节的calpain1和calpain2蛋白表达明显降低，见图7。

图7 pYr-Lvsh-CAPNS1-shRNA3转染Hela细胞对CAPNS1、Calpain1和Calpain2蛋白表达影响

3 讨 论

作为机体细胞内蛋白降解的主要酶系之一，钙蛋白酶系统对维持体内蛋白质代谢的平衡起着重要的作用。许多疾病与calpain的激活异常或失调有关[9]。Calpain在细胞周期、自噬、凋亡等过程中具有重要作用。研究表明，CAPNS1基因敲除后可致calpain1及calpain2活性下降，影响小鼠心脏发育，从而使其在妊娠中期死亡，表明CAPNS1在生物的生长和发育过程中起着重要的作用[5]。此外，有研究表明，CAPNS1对细胞自噬具有调节作用[2]。本课题组前期研究以及其他研究发现，calpain1和calpain2表达及活性的增加参与细胞自噬的调节[10]，但其机制至今还不是十分清楚，需进一步的研究。

RNA干扰是指双链RNA诱导具有同源性的靶基因序列的mRNA高效且特异性降解，从而抑制基因表达，引起基因沉默。RNA干扰技术虽存在高效性、特异性、可遗传等优点，且被广泛用于基因功能研究。但目前RNA干扰技术还存在脱靶效应、稳定性差、载体安全性等问题。本研究将合成的shRNA连接到含U6启动子载体的pYr-Lvsh质粒载体中，经酶切、琼脂糖凝胶电泳进行鉴定以及测序，结果显示pYr-Lvsh-CAPNS1-shRNA载体构建成功；同时，经转染Hela细胞后，细胞内CAPNS1 mRNA表达下降，其中pYr-Lvsh-CAPNS1-shRNA3转染细胞后其抑制效率最高，因此在后期选用其转染细胞后测定细胞中calpain活性及CAPNS1、calpain1和calpain2蛋白水平，结果发现calpain活性降低且CAPNS1、calpain1和calpain2蛋白表达量下降，为研究calpain的功能提供了基础。