李香妹,杨筱慧

(湖南师范大学生命科学学院,中国湖南长沙410081)

虫瘿是致瘿昆虫通过产卵和取食行为等持续刺激寄主植物并导致植物组织异常生长而形成的非正常组织,是致瘿昆虫和寄主植物相互作用的产物[1]。虫瘿对致瘿昆虫具有重要意义,包括以特化的虫瘿组织为致瘿昆虫幼虫提供糖类、脂类和蛋白质等营养物质;提供有利于抵御低温和过度干燥等不利环境胁迫的小环境;提供有利于防御捕食者和寄生者侵害的避难所[2]。

就虫瘿形成的适应性机制,目前有多种不同观点。Price等[3]提出6种假说,分别是营养、微环境、天敌、互利、防御和非适应假说。其中,营养假说认为虫瘿为致瘿昆虫提供丰富的营养物质,其营养物质的含量应高于植物未成瘿部位的相应组织,而次生代谢产物的含量则相反,以此满足致瘿昆虫的营养需求[2]。

致瘿昆虫的主要类群包括6目20科。其中,双翅目(Diptera)的瘿蚊科(Cecidomyiidae)和膜翅目(Hymenoptera)的瘿蜂科(Cynipidae)是两个最大的造瘿类群[4]。近年来,研究证实部分瘿蚜[5]、瘿蚊[6]和瘿蜂[7]等虫瘿支持营养假说。其中,瘿蜂虫瘿的主要营养成分有淀粉[8～9]、三酰甘油[10]和磷脂[11]。

栗瘿蜂(Dryocosmus kuriphilus)属于膜翅目瘿蜂科,营孤雌生殖,广泛分布于中国、日本、韩国、美国和欧洲部分国家,为世界性的检疫性害虫[12]。栗瘿蜂于栗芽或叶上形成虫瘿,其中,被害枝直接膨大形成的虫瘿称为枝瘿,叶片上形成的虫瘿称为叶瘿[13]。瘿蜂幼虫生活于虫瘿的虫室内,以虫瘿为食。成虫不取食虫瘿,在合适时机通过虫瘿羽化口逃离虫瘿[14]。目前,已有研究发现栗瘿蜂致瘿影响相邻叶片中单宁、类黄酮的含量和苯丙氨酸解氨酶的活性[15～17]。而且,相关研究探讨了栗树枝条和芽中的酚类化合物含量与抗栗瘿蜂性状的关系,结果显示栗树枝条和栗芽内酚类化合物含量与栗瘿蜂虫瘿百分率呈负相关[18～19]。此外,丁玉洲等[20]发现栗瘿蜂虫瘿的体积和质量与虫室数和虫数呈正相关。尽管已有上述报道,但是目前尚不清楚栗瘿蜂虫瘿是否支持营养假说。

本研究以栗瘿蜂幼虫期的虫瘿以及虫瘿着生的枝条为材料,测定其总蛋白质、淀粉和还原糖等营养物质以及单宁、类黄酮、多酚氧化酶和苯丙氨酸解氨酶等防御物质的含量或活性,以验证营养假说。

1 材料与方法

1.1 标本的采集和解剖

栗瘿蜂虫瘿和板栗枝条于2018年4月采集自湖南省邵阳市洞口县黄桥镇,以干冰保存,带回实验室。解剖虫瘿,取出幼虫后,将解剖的虫瘿用于后续检测。

1.2 试剂

总蛋白质、淀粉、还原糖、单宁、类黄酮、多酚氧化酶和苯丙氨酸解氨酶等物质的检测试剂盒购于苏州科铭生物技术有限公司。单宁含量检测试剂盒中的试剂有钨酸钠、磷钼酸、磷酸的混合溶液和Na2CO3溶液;类黄酮含量检测试剂盒中的试剂有亚硝酸钠、硝酸铝和NaOH;多酚氧化酶活性检测试剂盒中的试剂有 KH2PO4、K2HPO4·3H2O(含PVP)和邻苯二酚溶液;苯丙氨酸解胺酶活性检测试剂盒中的试剂有十水硼砂钠、硼酸(含EDTA和巯基乙醇)、苯丙氨酸和HCl溶液;还原糖含量检测试剂盒中的试剂有60%乙醇和3,5-二硝基水杨酸溶液;淀粉含量检测试剂盒中的试剂有60%乙醇和高氯酸溶液;总蛋白质含量检测试剂盒中的试剂有标准蛋白质溶液、BCA试剂。85%浓硫酸等其他试剂均购于生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.3 待测物的提取

1.3.1 单宁和类黄酮的提取

将样本烘干至恒重,分别取0.01 g已解剖的虫瘿和枝条,加入100 μL蒸馏水,充分捣匀后,80℃水浴30 min,8 000 g、25℃离心10 min,取上清液待用。

1.3.2 粗酶的提取

分别取0.01 g栗瘿蜂虫瘿和枝条至EP管中,加入100 μL的十水硼砂钠、硼酸溶液和巯基乙醇的混合液,冰浴匀浆,10 000 g、4℃离心10 min,取上清液至冰上待测。

1.3.3 还原糖的提取

取0.01 g栗瘿蜂虫瘿和枝条至EP管中,加入100 μL的60%乙醇溶液,冰浴匀浆,80℃水浴40 min并震荡 8～10次,随后 8 000 g、25℃离心10 min,取上清液待用。

1.3.4 淀粉的提取

取0.01 g栗瘿蜂虫瘿和枝条至EP管中,加入100 μL的60%乙醇溶液,充分捣匀后,80℃水浴30 min,随后3 000 g、25℃离心5 min,弃上清。在沉淀中加500 μL蒸馏水,95℃糊化15 min,然后加350 μL高氯酸溶液,25℃提取15 min,震荡3～5 次,再加 850 μL 蒸馏水混匀,随后 3 000 g、25℃离心10 min,取上清液待用。

1.3.5 总蛋白质的提取

取0.01 g栗瘿蜂虫瘿和枝条至EP管中,加入100 μL的蒸馏水,冰浴匀浆,随后8 000 g、4℃离心10 min,取上清液至冰上待测。

1.4 待测物的测定

1.4.1 单宁含量的测定

单宁在碱性环境下与磷钼酸反应,生成蓝色化合物,在760 nm处有最大吸收峰。依据该实验原理,文中采用钨酸钠-磷钼酸法测定单宁的含量,具体操作步骤参考单宁含量检测试剂盒说明书。

1.4.2 类黄酮含量的测定

类黄酮的测定采用碱性亚硝酸盐法。在碱性亚硝酸盐溶液中,类黄酮与铝离子形成在502 nm处有特征吸收峰的红色络合物,测定样品提取液在502 nm处的吸光值,即可计算样品中类黄酮的含量。具体操作步骤参考类黄酮含量检测试剂盒说明书。

1.4.3 苯丙氨酸解胺酶活性的测定

苯丙氨酸解胺酶催化L-苯丙氨酸裂解为反式肉桂酸和氨,反式肉桂酸在290 nm处有最大吸收值,通过测定吸光值的升高速率可计算苯丙氨酸解胺酶的活性。具体操作步骤参考苯丙氨酸解胺酶检测试剂盒说明书。

1.4.4 多酚氧化酶活性的测定

多酚氧化酶能够催化邻苯二酚产生醌,后者在525 nm处有最大吸收值,通过测定吸光值的升高速率可计算多酚氧化酶的活性。具体操作步骤参考多酚氧化酶检测试剂盒说明书。

1.4.5 还原糖含量的测定

还原糖含量的测定采用3,5-二硝基水杨酸法,通过加热促进碱性溶液中3,5-二硝基水杨酸溶液与还原糖生成棕红色氨基化合物,反应产物在540 nm有特征吸收峰。在一定的浓度范围内,还原糖含量与OD540nm呈线性关系,根据标准曲线,即可求出样品中还原糖的量。具体操作步骤参考还原糖含量检测试剂盒说明书。

1.4.6 淀粉含量的测定

首先利用80%乙醇把样品中的可溶性糖与淀粉分开,随后采用酸水解法分解淀粉为葡萄糖。采用蒽酮比色法测定葡萄糖含量,即可计算淀粉含量。具体操作步骤参考淀粉含量检测试剂盒说明书。

1.4.7 总蛋白质含量的测定

蛋白质含量的测定采用BAC法。碱性条件下,蛋白质中的半胱氨酸、胱氨酸、色氨酸、酪氨酸以及肽键能将Cu2+还原成Cu+;2分子的BCA与Cu+结合,生成紫色络合物,在540～595 nm有吸收峰,在562 nm处有最强的光吸收值,并与蛋白质浓度呈正比,据此可测定蛋白质浓度。具体操作步骤参考蛋白质含量检测试剂盒说明书。

1.5 数据分析

2 结果

栗瘿蜂幼虫期虫瘿的单宁含量为1.085±0.076 mg/g,极显著低于枝条的单宁含量1.821±0.032 mg/g(F1,38=79.424,P＜0.01;图 1)。栗瘿蜂虫瘿的类黄酮含量为16.457±1.216 mg/g,极显著低于枝条的类黄酮含量43.126±2.357 mg/g(F1,38=101.161,P＜0.01;图1)。此外,栗瘿蜂虫瘿的多酚氧化酶活性为55.902±2.243 U/g,显著低于枝条的多酚氧化酶活性 60.961±1.081 U/g(F1,38=4.126,P＜0.05;图 2)。栗瘿蜂虫瘿的苯丙氨酸解氨酶活性为7.763±0.509 U/g,极显著低于枝条的苯丙氨酸解氨酶活性 22.752±1.350 U/g(F1,38=107.852,P＜0.01;图 2)。上述结果表明,栗瘿蜂虫瘿中与防御相关的部分次生代谢产物的含量和酶的活性显著低于枝条,均支持营养假说。

图1 栗瘿蜂幼虫期虫瘿和枝条中单宁与类黄酮的含量比较Fig.1 Comparison of tannin and flavonoid contents in the galls and branches during the larvae stage of D.kuriphilus

图2 栗瘿蜂幼虫期虫瘿和枝条中苯丙氨酸解氨酶与多酚氧化酶的活性比较Fig.2 Comparison of phenylalanine ammonia-lyase and polyphenol oxidase activities in the galls and branches during the larvae stage of D.kuriphilus

栗瘿蜂幼虫期虫瘿中还原糖的含量为5.614±0.479 mg/g,极显著低于枝条中还原糖的含量 6.111±0.110 mg/g(F1,38=10.466,P＜0.01;图3)。虫瘿和枝条中淀粉的含量分别为16.859±0.346 mg/g和16.750±0.295 mg/g,二者无显著差异(F1,38=0.058,P＞0.05;图3)。虫瘿中总蛋白质的含量为1.865±0.161 mg/g,极显著低于枝条中总蛋白质的含量9.420±0.253 mg/g(F1,38=635.196,P＜0.01;图 3)。上述结果表明,栗瘿蜂虫瘿中淀粉的含量与枝条中淀粉的含量无显著差异,但虫瘿中的还原糖和总蛋白质含量均显著低于枝条中对应物质的含量,不支持营养假说。

图3 栗瘿蜂幼虫期虫瘿和枝条中还原糖、淀粉与总蛋白质含量的比较Fig.3 Comparison of reducing sugar,starch and protein contents in the galls and branches during the larvae stage of D.kuriphilus

3 讨论

营养假说认为,虫瘿营养物质的含量应高于植物正常组织,而防御物质应低于植物的相应组织,以满足致瘿昆虫的营养需求[3]。本文就栗瘿蜂虫瘿的部分营养和防御物质是否支持营养假说进行研究。

研究结果表明栗瘿蜂虫瘿的防御物质单宁和类黄酮的含量及多酚氧化酶和苯丙氨酸解氨酶的活性均显著低于寄主植物枝条中相应物质的含量或活性。单宁是一种酚类物质,能与昆虫消化酶结合抑制酶的活性,从而降低昆虫营养物质的消化利用以抑制昆虫的生长发育[21]。我们的研究与其他瘿蜂Andricus petiolicolus和Trigonaspis sp.虫瘿单宁含量的研究[22～23]一致。类黄酮影响昆虫生长和发育,吕文玲[24]的研究表明鸭脚木星室木虱(Pseudophacopteron alstonium)为害初期,虫瘿组织黄酮含量显著降低。栗瘿蜂虫瘿内较低含量的单宁和类黄酮有利于瘿蜂幼虫的生长和发育。

多酚氧化酶广泛分布于植物和昆虫体内。植物中,多酚氧化酶可引起组织的褐变,而昆虫中的多酚氧化酶主要与表皮的硬化和褐化有关[25]。虫瘿被瘿蜂幼虫取食后,其多酚氧化酶一方面能共价修饰昆虫的消化蛋白并与之交联,降低昆虫中肠蛋白酶的水解能力;另一方面,多酚氧化酶能作用于多酚形成醌,而醌对昆虫具有毒性。我们的研究表明栗瘿蜂虫瘿的多酚氧化酶活性显著低于枝条,这支持营养假说。但是,汪少妃等[26]证实刺桐姬小蜂(Quadrastichus erythrinae)虫瘿的多酚氧化酶活性显著高于寄主植物。我们的结果与其并不一致,这可能与致瘿昆虫和寄主植物的种类相关。

苯丙氨酸解氨酶存在于绿色植物中,是催化苯丙烷类代谢第一步反应的关键酶,也是限速酶,目前尚无研究表明昆虫体内存在苯丙氨酸解氨酶[27]。L-苯丙氨酸经苯丙氨酸解氨酶作用生成反式肉桂酸,进入苯丙烷代谢途径并经中间产物可转化为类黄酮和单宁。我们的研究表明,虫瘿中单宁和类黄酮的含量显著低于枝条,而苯丙氨酸解氨酶的活性亦如此。我们推测,虫瘿中单宁和类黄酮的含量较低,这可能与苯丙氨酸解氨酶活性较低有关。

糖和蛋白质是昆虫所必需的营养物质。黄金水等[28]的研究表明木麻黄木质部中葡萄糖含量的增加,为星天牛(Anoplophora chinensis)提供丰富的能量,提高星天牛的存活率。我们的研究结果表明,栗瘿蜂虫瘿的还原糖含量低于枝条,淀粉的含量与枝条相比无显著性差异,这与营养假说不符。就蛋白质含量而言,研究已证实蚜虫、瘿蚊和瘿蜂虫瘿的总氮含量低于未成瘿组织[7,29～30];瘿蚊 Bruggmanniella sp.及瘿蜂 Andricus kollari、Diplolepis rosae、Dryocosmus spinosa 和 A.petiolicolus虫瘿的可溶性蛋白质含量低于未成瘿组织[22,31]。本文的研究结果也显示,栗瘿蜂虫瘿的蛋白质含量极显著低于枝条的含量,不支持营养假说。

综上所述可知,就栗瘿蜂幼虫期的虫瘿而言,并非所有营养物质的含量均支持营养假说。我们推测,这可能与瘿蜂虫瘿的复杂结构有关。瘿蜂虫瘿包括表皮层、保护层和营养层[32],瘿蜂幼虫以邻近幼虫的营养层细胞为食。我们的结果表明,营养层组织的营养物质可能含量较低,而防御物质的含量较高,而我们以整个虫瘿为研究对象,因此部分检测结果不符合营养假说。考虑到栗瘿蜂营养层与保护层是连续且不规则的,因此需寻找合适的方法将营养层和保护层分离后开展进一步研究。

此外,栗瘿蜂幼虫期虫瘿的部分防御物质的含量或活性低于枝条,而部分营养物质(如还原糖和总蛋白质)的含量亦低于枝条。我们推测,这可能与栗瘿蜂幼虫和寄主植物的适应性策略相关。一方面,瘿蜂幼虫可能使虫瘿中部分防御物质的含量或活性低于枝条,从而有利于自身的生长和发育;另一方面,寄主植物可能通过改变虫瘿还原糖和总蛋白质的含量以降低食物的质量,从而影响瘿蜂幼虫的发育,这两方面在一定程度上取得平衡。