肖维威,张 宝,赵 卫,朱 利,吴清华

(南方医科大学公共卫生学院,中国广东广州510515)

随着基因工程为代表的生物技术的迅猛发展,转基因作物自1996年种植商业化以来,其种植规模越来越大。据国际农业生物技术应用服务组织(ISAAA)统计,全球转基因作物的种植面积从1996年的170万公顷增加到2017年的1.898亿公顷,足足增长了112倍[1]。

转基因作物种植面积增长越多,呈现在公众视野的转基因产品也就越多。转基因产品在中长期可能存在潜在的健康和环境风险[2],这给转基因作物以及转基因产品的安全管理带来了巨大的挑战。为保障消费者的知情权和选择权,我国《农业转基因生物标识管理办法》和《转基因食品卫生管理办法》规定对转基因产品必须进行标识。而对转基因产品中的转基因成分进行定性定量检测是转基因生物安全管理和标识的重要一环。目前转基因成分的检测分析分为基于外源基因的检测技术和基于外源基因表达蛋白的检测技术两大类[2]。因为核酸的稳定性和普遍性,所以基于外源基因的检测技术应用更为广泛[3]。外源基因检测的靶标包括启动子、报告基因、目的基因和终止子,其中启动子和终止子是表达外源目的基因所必需的调控元件。CaMV35S启动子、NOS终止子是转基因作物中使用时间最早、使用频率最高的启动子和终止子[4～6]。因此,针对 CaMV35S 启动子、NOS终止子的检测可用于待检样品中转基因成分的初步筛查和检测。

实际检测工作中,标准物质(阳性对照)的缺乏,已严重影响到转基因检测技术的标准化、转基因生物安全管理以及转基因产品标识制度的执行[7]。本文采用有别于传统酶切连接方式的重叠延伸PCR技术[8],设计带有互补接头的特异性引物,快速构建包含CaMV35S启动子、NOS终止子和植物通用内源基因RBCL的质粒标准分子,以期作为一种新型的阳性对照广泛应用于转基因作物成分的筛查检测。

1 材料和方法

1.1 材料

转基因大豆GTS40-3-2、转基因玉米Bt11标准品购自欧洲IRMM (Institute of Reference Materials and Measurement)。

1.2 主要试剂

Premix Taq DNA聚合酶、Premix Ex Taq DNA聚合酶、pMD18-T载体、DNA分子量marker等购自宝生物工程(大连)有限公司;凝胶回收试剂盒、质粒小提试剂盒购自OMEGA公司(美国);DH5α菌株为本实验室保存;引物及探针由上海Invitrogen生物公司合成,序列见表1。

表1 重叠延伸PCR引物Table 1 Primers used for overlap extension PCR

1.3 基因组总DNA的提取

参照国家标准CTAB-2法[9],提取转基因大豆GTS40-3-2和转基因玉米Bt11的基因组DNA。

1.4 重叠延伸PCR重组CaMV35S启动子、NOS终止子和RBCL基因

将提取的转基因大豆GTS40-3-2基因组DNA用表1中的引物分别扩增内源基因RBCL、Ca-MV35S启动子和NOS终止子。反应体系:DNA 模板 1.0 μL(50 ng),2× Premix Taq 12.5 μL,10.0 μmol/L 上、下游引物各 1.0 μL,补水至 25.0 μL。反应程序:94℃预变性5 min;94℃变性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸30 s,循环30次;72℃延伸7 min。以RBCL和CaMV35S启动子带接头的PCR产物作为双模板,各取0.5 μL,加2×Premix Taq 25.0 μL,补水至50.0 μL反应体系。在94℃预变性2 min;94℃变性30 s,72℃延伸30 s,并循环10次进行延伸反应,得到重组片段RBCLCaMV35S(图1)。以NOS终止子扩增产物和RBCL-CaMV35S片段作为双模板,各取0.5 μL,加2×Premix Taq 25.0 μL,补水至 46.0 μL 反应体系。在94℃预变性2 min;94℃变性30 s,72℃延伸30 s,并循环10次进行延伸反应,得到重组片段RBCL-CaMV35S-NOS(图 2)。补加 RBCL-F 和 NOSR引物各2.0 μL,使反应体系总体积达到50.0 μL,随后PCR扩增重组片段RBCL-CaMV35S-NOS。反应程序:94℃预变性2 min;94℃变性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸30 s,循环30次;72℃延伸7 min。

1.5 AT克隆

按照pMD18-T载体试剂盒说明书,将上述重叠延伸PCR重组片段RBCL-CaMV35S-NOS与pMD18-T载体连接,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。在含Amp+的固体培养基平板上过夜培养,随机挑取白色菌落进行快速PCR筛查。

1.6 PCR鉴定

图1 重叠延伸PCR重组RBCL与CaMV35S的示意图Fig.1 Sketch map of recombination of the RBCL and CaMV35S fragments by overlap extension PCR

图2 重叠延伸PCR重组RBCL-CaMV35S与NOS的示意图Fig.2 Sketch map of recombination of the RBCL-CaMV35S and NOS fragments by overlap extension PCR

挑取白色菌落,接种到含Amp+的LB液体培养基中,250 r/min震荡培养5 h后,取200 μL菌液在6 000 r/min条件下离心5 min,去上清液。在沉淀中加20 μL灭菌水重新悬浮,将其放在沸水锅煮10 min左右后,在12 000 r/min条件下离心3 min,取含有质粒的上清1～2 μL作为模板,用pMD18-T载体通用引物Tvector-1(5′-GTA AAA CGA CGG CCA GT-3′)和 Tvector-2(5′-CAG GAA ACA GCT ATG AC-3′)进行扩增筛选。反应体系:上清液 1.0 μL,2× Premix Ex Taq 10 μL,5.0 μmol/L的pMD18-T载体通用引物Tvector-1和Tvector-2各1.0 μL,补水至25.0 μL。反应参数:95℃预变性4 min;95℃变性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸30 s,循环30次。

1.7 序列分析

根据PCR筛查结果继续扩大培养阳性克隆菌,提取质粒,送华大基因公司进行测序。

1.8 替代性分析

对质粒DNA与基因组DNA进行可替代性研究。分别提取pMD-RBCL-CaMV35S-NOS重组质粒DNA与转基因大豆GTS40-3-2、转基因玉米Bt11基因组DNA,采用表2检测引物(不带引物接头)分别扩增RCBL、CaMV35S和NOS基因片段进行进一步鉴定。反应体系:模板DNA分子1.0 μL,2× Premix Ex Taq 12.5 μL,5.0 μmol/L 的上、下游引物各1.0 μL,补水至25.0 μL。反应参数:95℃预变性4 min;95℃变性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸30 s,循环30次。

2 结果与分析

2.1 RBCL基因、CaMV35S启动子和NOS终止子的扩增

用RBCL-F与RBCL-R+引物扩增转基因大豆GTS40-3-2的内源基因RBCL,目的片段为454 bp;用35S-F+与35S-R+引物扩增CaMV35S启动子,目的片段为236 bp;用NOS-F+与NOS-R引物扩增NOS启动子,目的片段为200 bp。结果如图3所示,扩增产物与预期目的片段大小一致。

2.2 RBCL基因、CaMV35S启动子和NOS终止子的重叠延伸PCR重组

图3 RBCL、CaMV35S启动子和NOS终止子的扩增结果M:DL500 marker;1,2:RBCL扩增产物;3,4:CaMV35S扩增产物;5,6:NOS扩增产物。Fig.3 Analysis of the amplification fragments of RBCL,CaMV35S promoter and NOS terminator in 2%agarose gelM:DL500 marker;1,2:Amplification products of RBCL;3,4:Amplification products of CaMV35S promoter;5,6:Amplification products of NOS terminator.

RBCL扩增产物和CaMV35S启动子扩增产物通过接头互补,经重叠延伸PCR重组得到RBCL-CaMV35S片段,再将RBCL-CaMV35S片段与NOS终止子扩增产物混合,通过35S-R+引物与NOS-F+引物的完全互补,重叠延伸PCR重组得到RBCL-CaMV35S-NOS片段,大小为849 bp。结果如图4所示,扩增产物与预期片段大小一致。

图4 RBCL、CaMV35S启动子和NOS终止子的重叠延伸PCR重组结果1,2:RBCL-CaMV35S-NOS重组片段;M:DL2000。Fig.4 Analysis of the recombination fragments of RBCL,CaMV35S promoter and NOS terminator by overlap extention PCR in 2%agarose gel1,2:Recombination products of RBCL-CaMV35S-NOS;M:DL2000.

表2 PCR检测引物Table 2 Primers used for PCR detection

2.3 PCR鉴定

重组片段RBCL-CaMV35S-NOS经AT克隆后,从培养板随机挑取6个菌落进行初步筛查,以阳性克隆菌液作为模板,用pMD18-T载体通用引物 Tvector-1(5′-GTA AAA CGA CGG CCA GT-3′)和 Tvector-2(5′-CAG GAA ACA GCT ATG AC-3′)进行扩增。结果如图5所示,4号、5号克隆扩增产物与目的片段大小接近。

图5 PCR鉴定阳性克隆1～6:1～6 号克隆扩增结果;M:DL2000。Fig.5 Analysis of the PCR products in 2%agarose gel1～6:Amplification products of 1～6 clones;M:DL2000.

2.4 序列分析

根据上述PCR鉴定结果,挑选其中的4号、5号阳性克隆菌提取质粒送华大基因公司测序,测序结果如图6所示。经DNASTAR-MegAlign比对,与预期序列相吻合,说明包含RBCL、CaMV35S、NOS基因片段的重组质粒构建成功。将该重组质粒命名为pMD-RBCL-CaMV35S-NOS,其物理图谱见图7。

2.5 替代性研究

提取pMD-RBCL-CaMV35S-NOS重组质粒DNA与标准品转基因大豆GTS40-3-2、转基因玉米Bt11的基因组DNA作为模板,分别扩增RCBL、CaMV35S和NOS基因片段,结果如图8所示:质粒DNA与标准品基因组DNA扩增的3个片段大小一致,与预期的433 bp、195 bp和180 bp大小相符,说明可以替代为阳性标准物质进行检测分析。

3 讨论

目前针对转基因产品外源基因的检测方法主要有核酸分子杂交技术(如Southern-blot)、PCR检测技术和基因芯片技术[10]等。为保证检测结果的可靠性,外源基因的检测都必须以一种准确、可靠、稳定的标准物质作为阳性对照。传统的标准物质是以转基因材料与其对应的非转基因材料按一定的质量比例配制而成[7],目前主要依靠从国外购买,不仅价格高,而且购买很不方便,严重影响日常转基因检测工作及检测技术研究的开展,因此亟需研制新型阳性对照材料。

质粒标准分子是一种含有目的基因和内参基因的特异性片段的重组质粒分子。与传统的阳性标准物质相比,质粒标准分子具有以下几方面的优点:1)可以通过微生物进行大量培养无限获得,提取简便,纯度高,用量少;2)可长期保存,稳定性好,使检测结果的准确性得到很大的提高;3)同一个标准分子可设计同时重组多个外源基因,经济高效,是GMO(genetically modified organism)鉴定检测中很好的阳性标准物质替代物。因此,构建阳性质粒标准分子已成为国际上转基因检测领域的研究热点[11～12]。

目前国际上所构建的标准分子都是将1个转基因作物品系的内参基因和目的基因同时克隆到1个质粒中,在做不同作物转基因成分的检测时,需要多个标准分子,比较繁琐[13]。本研究将大豆、玉米、油菜和水稻等转基因作物常用的CaMV35S启动子、NOS终止子和植物内参基因RBCL同时克隆到pMD18-T载体中,获得了pMD-RBCLCaMV35S-NOS重组质粒。RBCL基因作为转基因作物检测的共同内参基因,克服了现行的“一种作物需要一种检测内对照”的弊病。据统计,约80%～85%的商业化转基因作物使用了该CaMV35S启动子,90%以上的转基因作物使用了NOS终止子[14～15]。因此选用CaMV35S启动子和NOS终止子作为转基因作物成分的检测靶标,是筛查检测转基因产品最简单而又行之有效的方法。而且,对一些未经授权或外源基因信息尚未公开的转基因产品,CaMV35S启动子或/和NOS终止子的检测甚至是唯一可行的方法。

质粒标准分子的构建一般采用酶切方式,但有时并不一定能够找到合适的酶切位点。本研究采用重叠延伸PCR技术,不需要限制性内切酶,通过设计部分互补(接头互补)或完全互补的特异性引物,将RCBL、CaMV35S启动子和NOS终止子的基因片段通过PCR扩增、重叠延伸分步连接起来,再将连接片段克隆至pMD18-T载体,获得重组质粒标准分子pMD-RBCL-CaMV35S-NOS。重叠延伸PCR技术除可应用于不同DNA片段的重组构建之外,还可以应用于突变基因的构建[16～17]、长片段基因的合成[18～19]、多基因序列的拼接[20～21]等研究。

图6 重组质粒序列分析结果Fig.6 Sequences of the integrated DNAs in the recombination plasmid

图7 pMD-RBCL-CaMV35S-NOS重组质粒示意图Fig.7 Schematic illustration of the recombinant plasmid pMD-RBCL-CaMV35S-NOS

图8 PCR检测结果M:DL500;1:质粒RBCL扩增产物;2:GTS40-3-2 RBCL扩增产物;3:Bt11 RBCL扩增产物;4:质粒CaMV35S扩增产物;5:GTS40-3-2 CaMV35S扩增产物;6:Bt11 CaMV35S扩增产物;7:质粒NOS扩增产物;8:GTS40-3-2 NOS扩增产物;9:Bt11 NOS扩增产物。Fig.8 Analysis of the PCR products in 2%agarose gelM:DL500;1:RBCL amplification products from plasmid;2:RBCL amplification products from GTS40-3-2 genome;3:RBCL amplification products from Bt11 genome;4:CaMV35S amplification products from plasmid;5:CaMV35S amplification products from GTS40-3-2 genome;6:CaMV35S amplification products from Bt11 genome;7:NOS amplification products from plasmid;8:NOS amplification products from GTS40-3-2 genome;9:NOS amplification products from Bt11 genome.

本研究通过重叠延伸PCR技术成功构建了pMD-RBCL-CaMV35S-NOS质粒标准分子,通过针对CaMV35S启动子和NOS终止子的检测分析证实,该质粒标准分子可替代阳性标准品广泛应用于转基因作物成分的初步筛查检测。