王英泽 曹晴晴 王晨晨 刘桂沅 杜朝

摘要：为了探讨中药复方对小鼠脾脏淋巴细胞PD-1/PD-L1的表达情况，以及CD3+CD4+和CD3+CD8+T淋巴细胞比例的影响，采用传统熬制中药的方法得到中药复方提取液，按低、中、高3个浓度对小鼠灌胃给药（1次/d），2周后，采用脑脊髓脱臼法处死小鼠，利用Real-time PCR和流式细胞仪检测脾脏PD-1/PD-L1的表达情况以及淋巴细胞亚型的变化。结果表明，随着中药提取液浓度的增加，脾脏淋巴细胞PD-1的表达显著降低，而PD-L1的表达无显著变化;CD3+CD4+型和CD3+CD8+型T淋巴细胞的比例均显著增加。所研制的中药复方能抑制淋巴细胞PD-1的表达，激活免疫辅助细胞和效应细胞，有望应用于抗肿瘤的免疫治疗。

关键词：细胞免疫学;中药复方;T淋巴细胞;PD-1/PD-L1;CD3+CD4+/CD3+CD8+

中图分类号：R2855文献标志码：A

WANG Yingze， CAO Qingqing， WANG Chenchen， et al.Effect of a kind of Chinese herbal compound on the expression of PD-1/PD-L1 in spleen lymphocytes of mice[J].Journal of Hebei University of Science and Technology，2019，40（1）：32-37.Effect of a kind of Chinese herbal compound on the expression of

PD-1/PD-L1 in spleen lymphocytes of mice

WANG Yingze1， CAO Qingqing1， WANG Chenchen1， LIU Guiyuan2， DU Chao1

（1.School of Biological Science and Engineering， Hebei University of Science and Technology， Shijiazhuang，Hebei 050018， China; 2. Langfang Institute of Traditional Chinese Medicine，Langfang，Hebei 065000，China ）

Abstract：In order to investigate the effect on the expression of PD-1/PD-L1 and the proportion of CD3+CD4+， CD3+CD8+ T lymphocyte in spleen lymphocytes of mice treated with Chinese herbal compound， the extract of Chinese herbal compound is obtained by traditional boiling method. The mice are given intragastric administration once a day with extract of Chinese herbal compound at low， medium and high concentrations. The mice are sacrificed by neck dislocation at the end of experiment time and the spleen is freshly isolated from mice. The expression of PD-1/PD-L1 and the changes of lymphocyte subtypes are detected by Real-time PCR and flow cytometry. The results show that the expression of PD-1 on splenic lymphocytes decreases significantly and the ratio of CD3+CD4+ and CD3+CD8+ T lymphocytes increases significantly with the increase of the concentration of Chinese herbal compound， but the expression of PD-L1 does not change significantly. These results suggest that the Chinese herbal compound can be used in anti-tumor immunotherapy mediated by inhibiting the expression of PD-1 in lymphocytes， activating immune helper cells and effector cells.

Keywords：cell immunology; Chinese herbal compound; T lymphocyte; PD-1/PD-L1; CD3+CD4+/CD3+CD8+

PD-1（programmed cell death 1， 程序性死亡受體1，CD279）来源于CD28家族，主要在活化的T细胞、B细胞、自然杀伤（NK）细胞、巨噬细胞等免疫细胞中表达[1-2]，其配体PD-L1（也称B7-H1/CD274）主要在肿瘤细胞和抗原提呈细胞（APC）中表达。PD-L1与T细胞PD-1结合会导致T细胞的衰竭与功能障碍，并分泌促炎因子如TNF-α，IL-2，IFN-γ[3]。利用抗PD-1或抗PD-L1单克隆抗体可阻断PD-1/PD-L1相互作用，从而减轻对T细胞的抑制[4]。研究表明，通过阻断PD-1/PD-L1的相互作用，可显著提高特异性的T淋巴细胞对骨肉瘤的杀伤效果，延长荷瘤鼠的存活时间[5]。迄今，PD-1/PD-L1阻断剂作为一种通过调节免疫细胞与肿瘤细胞相互作用的癌症治疗方法，展现出显著的抗肿瘤效应[6]，是目前具有较好应用前景的肿瘤治疗途径。

河北科技大学学报2019年第1期王英泽，等：一种中药复方对小鼠脾脏淋巴细胞PD-1/PD-L1表达的影响中药作为一种纯天然的药物，具有抗肿瘤、抗氧化、抗病毒[7]以及促进免疫调节等多种生物活性，因其在疾病治疗过程中具有耐药性低、毒副作用小、无残留及增强机体免疫力等优点而倍受研究者的关注。近年来的研究发现，黄芪、金银花、野菊花、甘草等中药成分能够通过提高机体的固有免疫和特异性免疫能力发挥免疫调节、抗肿瘤、抗氧化等功能，而这些功能的发挥主要与中药中所含的多糖、黄酮类、苷类等活性成分有关[8-13]。这些复方成分针对抗肿瘤机制的研究主要集中在抗氧化、阻滞细胞周期、促凋亡和抑制新生血管生成等方面[14-15]，而针对与肿瘤免疫逃逸相关的PD-1/PD-L1免疫检查点的研究未见报道。

笔者采用上述中药成分，配以鬼针草、半枝莲组成中药复方，采用低、中、高剂量灌胃法处理小鼠，从分子和细胞水平检测了小鼠脾脏PD-1和PD-L1的表达情况，在细胞水平分析了T淋巴细胞亚群CD3+CD4+和CD3+CD8+表达的变化，探讨中药复方对小鼠T淋巴细胞的免疫调节作用。

1材料与方法

1.1主要试剂及仪器

中药复方（黄芪20 g、金银花10 g、野菊花15 g、鬼针草20 g、半枝莲20 g、甘草5 g）;小鼠淋巴细胞分离液（达科为，产地北京）;TRIzol（Invitrogen）;RPMI-1640培养基（Gibco）;胎牛血清（HyClone）;Anti-Mouse CD274（B7-H1）PE，Anti-Mouse CD274（PD-1）FITC，Anti-Mouse CD3e FITC，Anti-Mouse CD4 PE，Anti-Mouse CD8a（B7-1）APC（eBioscience）。

实时荧光定量PCR仪（IQ5，Bio-Rad），细胞分选仪（accuri C6，BD公司生产），超微量分光光度计（DS-11+，DeNovix）。

1.2方法

1.2.1中药复方的制备

称取黄芪20 g、金银花10 g、野菊花15 g、鬼针草20 g、半枝莲20 g、甘草5 g，粉碎，经3次煎煮，离心（5 000 r/min）后取上清液，经0.2 μm滤器过滤除菌，配制成浓缩液（总药材量/药液体积：100 mg/mL）。用无菌水将药物浓缩液稀释至10 mg/mL和50 mg/mL，于4 ℃保存。

1.2.2实验动物分组及处理

清洁级Balb/c小鼠，体质量（18±2）g，购自河北医科大学实验动物中心。适应性喂养小鼠7 d后，将15只小鼠随机分成5组（每组3只），分别为空白对照组、生理盐水组、低剂量组（100 mg/kg）、中剂量组（500 mg/kg）、高剂量组（1 000 mg/kg），每日灌胃1次。灌胃期间不限饮食，自由饮水，隔天称重并观察各组小鼠生长情况。2周后，所有小鼠均禁食12 h，采用脑脊髓脱臼法处死。取出脾脏，以生理盐水冲洗后，将50 mg左右的脾脏经液氮冻存后置于-80 ℃冰箱中保存，用于提取RNA;其余脾脏经分离得到脾脏淋巴细胞后，用于检测细胞表面的PD-1蛋白表达情况及CD34+和CD38+表型比例的变化。

1.2.3Real-time PCR

取50 mg脾脏组织，采用Trizol法提取总RNA，采用超微量分光光度计测定RNA浓度，判定纯度后，反转录成cDNA，以此cDNA 作为模板，进行Real-time PCR扩增，以GAPDH作为内参基因。扩增PD-1的程序如下：95 ℃，10 min;95 ℃，15 s;60.9 ℃，1 min;40 cycles。扩增PD-L1的程序如下：95 ℃，10 min;95 ℃，15 s;60.1 ℃，1 min;40 cycles。50 μL反应体系，其中25 μL 2×SYBR Green mixture，10 μmol/L正向和反向引物各2 μL，10 μL cDNA，11 μL无RNase水，混匀后，分至3管，每管15 μL。引物序列见表1。

1.2.4脾脏淋巴细胞分离

采用脑脊髓脱臼法处死小鼠，浸泡于75%（体积分数，下同）的乙醇中，在超净台上取出小鼠脾脏，在35 mm培养皿中放入1～2 mL淋巴细胞分离液，研磨至碎片。把悬有脾脏细胞的分离液转移到15 mL离心管中，覆盖200～500 μL的RPMI-1640培养基，室温，800×g离心30 min，吸出淋巴细胞层移至新管。再加入0.5 mL RPMI-1640培养基，室温，500×g离心10 min，收集细胞，用RPMI-1640培养基（含10%胎牛血清）悬浮细胞，计数。

1.2.5脾脏淋巴细胞的表型及PD-1的流式检测

将收集得到的淋巴细胞用预冷的PBS清洗2遍，100 μL PBS（预冷）重悬，加入相应抗体，于冰上避光孵育30 min，利用细胞流式仪进行检测。

1.2.6统计学处理

本实验所有数量值均采用x±s表示，组间比较采用t检验，数据经SPSS 22.0软件进行统计分析。

2结果与分析

2.1中药复方对小鼠体质量变化无影响

为探讨药物剂量是否影响小鼠的生长状况，对各组小鼠的体质量隔日称重，持续2周。图1 a）显示，与生理盐水组相比，不同剂量的中药复方处理对小鼠体质量的变化無显著影响（P>0.05），表明在实验设定的剂量浓度下，中药复方对小鼠的正常生长状态无毒性作用。

2.2中药复方能下调小鼠脾脏淋巴细胞PD-1基因的表达水平

为探讨中药复方能否干扰淋巴细胞PD-1/PD-L1基因的表达，利用Real-time PCR检测不同剂量中药复方对小鼠脾脏PD-1和PD-L1 mRNA表达水平的影响情况，结果见图1 b）。与生理盐水组相比，低浓度的中药复方处理即可显著降低PD-1的mRNA水平（P<0.05），而且，随着中药复方浓度的逐渐提高，PD-1 mRNA表达水平的降低幅度逐渐增大，表明中药复方可以显著下调小鼠脾脏组织PD-1 mRNA的表达，且呈现出明显的浓度依赖效应。与此不同，对脾脏组织中PD-L1 mRNA的表达水平虽有一定抑制，但差异不显著（P>0.05），表示此中药复方可能只是通过干扰PD-1的表达来降低肿瘤免疫逃逸。

2.3中药复方能显著降低小鼠脾脏淋巴细胞PD-1蛋白表达的水平

為探究中药复方处理对PD-1 mRNA水平的影响能否反映其在蛋白水平的变化情况，采用流式细胞术分析了小鼠脾脏淋巴细胞表面PD-1蛋白表达的情况。由图2可知，不同浓度的中药复方处理都使小鼠脾脏淋巴细胞表面的PD-1蛋白量减少（P<0.05），但不存在浓度依赖效应。这些结果表明，在中药复方的作用下，小鼠脾脏淋巴细胞表面PD-1蛋白水平与相应的mRNA水平变化趋势一致，推测中药复方可能抑制PD-1的转录或影响其mRNA稳定性，从而减少细胞表面PD-1蛋白的表达量。T细胞表面PD-1蛋白的减少有助于抑制肿瘤免疫逃逸，这可能是中药复方保护和调节机体免疫系统的重要分子基础。

2.4中药复方能提高小鼠脾脏中CD3+CD4+/CD3+CD8+型T淋巴细胞的比例

为探讨中药复方对小鼠脾脏T淋巴细胞亚型的影响，采用流式细胞术检测CD3+CD4+和CD3+CD8+型T淋巴细胞的比例，结果见图3。与生理盐水组相比，当给予低剂量的中药复方时，小鼠脾脏中CD3+CD4+和CD3+CD8+型T淋巴细胞的比例均显著降低;给予中剂量处理后，CD3+CD4+和CD3+CD8+型T淋巴细胞比例有所增加;给予高剂量处理后，CD3+CD4+和CD3+CD8+型T淋巴细胞的比例均显著提高，分别达20.9%和11.3%（P<0.05），表明中药复方能够显著提高小鼠脾脏淋巴细胞的CD3+CD4+和CD3+CD8+型比例，其变化趋势与处理剂量有关，初步说明中药复方具有通过激活机体免疫抑制肿瘤的潜质。

3讨论

1）脾脏作为机体重要的淋巴器官，聚集着大量的淋巴细胞和巨噬细胞，在机体细胞免疫和体液免疫中发挥着关键作用。中药复方对特异性免疫和非特异性免疫均有促进作用，除了具有提高机体免疫力、抗病毒、抗氧化等功效外，中药复方亦能够通过激活T淋巴细胞、B淋巴细胞和巨噬细胞等免疫细胞，促进产生细胞因子，从而激活补体系统等方式调节机体免疫系统[16-17]。在免疫力低下的情况下，中药复方能够促进血清中的免疫球蛋白和溶血素含量升高，增强腹腔巨噬细胞的吞噬能力，从而提高小鼠的免疫功能[18]。

2）在肿瘤治疗过程中，如何克服免疫逃逸一直是备受关注的课题。癌细胞会采用各种策略，利用免疫检验点，逃避抗肿瘤免疫，如引发具有肿瘤反应活性的细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T-lymphocytes， CTLs）功能衰竭。PD-1作为一个主要的检验点受体，在结合其配体PD-L1后，可以通过抑制T细胞受体（T cell receptor， TCR）的下游信号，抑制T细胞的功能。肿瘤微环境（tumor microenvironment， TME）中PD-1的配体特别是PD-L1的表达，能使癌细胞免受免疫介导的排斥作用[19-20]。以针对PD-1/PD-L1通路抗体为基础治疗的许多方法已进入临床研发阶段，或已被批准用于治疗黑色素瘤等[21]。本研究针对中药复方是否影响小鼠T淋巴细胞功能相关的免疫检查点PD-1/PD-L1的表达开展了相关研究。实验结果显示，经过药物处理后，小鼠脾脏T淋巴细胞的PD-1表达量显著减少。PD-1的mRNA水平和蛋白水平变化趋势一致，而且mRNA水平的变化呈现出剂量依赖效应，说明中药复方可能是通过抑制PD-1基因转录，或降低其mRNA稳定性发挥作用。中药复方降低T淋巴细胞表达的PD-1，有助于抑制肿瘤免疫逃逸。因此上述结果初步阐明了中药复方具备调节机体免疫系统的能力。

3）具有肿瘤反应活性的CD3+CD4+和CD3+CD8+型T淋巴细胞的比例在经高剂量药物处理后显著增加，提示中药复方有助于激活免疫辅助细胞和效应细胞，这可能也是其调控免疫能力的分子基础之一。

4结语

1）利用黄芪、金银花等6种成分组成的中药复方处理小鼠，探讨了其对脾脏淋巴细胞PD-1/PD-L1免疫检查点的影响。结果显示，此中药复方可以显著降低脾脏淋巴细胞PD-1的表达，提高CD3+CD4+型和CD3+CD8+型T淋巴细胞的比例。说明此中药复方能干扰免疫检查点PD-1/PD-L1的表达，激活免疫辅助细胞和效应细胞，为中药用于抗肿瘤的免疫治疗研究提供了数据参考。

2）中药复方抑制T淋巴细胞PD-1基因表达呈现出一定的特异性，因为脾脏组织中PD-L1基因的表达情况并没有因药物处理而发生显著变化。采用PD-1抗体治疗黑色素瘤的有关研究显示，黑色素瘤细胞亦可表达PD-1，促进自身增殖。在阻断免疫检验点的同时，抗体还能通过作用于肿瘤表面的PD-1抑制肿瘤生长[22]。中药复方是否能够通过抑制肿瘤细胞的PD-1表达来抑制肿瘤，是今后需要进一步关注的重点。

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2019年2月Journal of Hebei University of Science and TechnologyFeb. 2019