机械加载对大鼠薄型子宫内膜的修复作用

2019-05-23田甜刘大全李心乐邵珩张平

天津医药 2019年5期

田甜，刘大全，2，李心乐，邵珩，张平，2△

薄型子宫内膜是指子宫内膜的厚度低于能够获得妊娠的阈厚度［1］。过度刮宫、内分泌失调、宫腔粘连等多种因素可导致子宫内膜变薄，影响子宫内膜容受性，导致体外受精-胚胎种植（IVF-ET）失败，增加流产的风险，不能维持妊娠，是目前生殖医学界的一大难题［2］。Miwa等［3］研究表明薄型子宫内膜的主要特征为子宫动脉血流高阻力、腺上皮生长受限、血管内皮生长因子（VEGF）低表达和血管发育不良。针对这一难题，临床上常以大剂量雌激素治疗为主，加以其他辅助性治疗药物如阿司匹林、枸橼酸氯米芬及维生素E等，但效果并不理想，甚至有些患者对药物治疗无反应［4］。机械加载能够在一定程度上模拟人体主动运动，以一定的加载频率对膝关节等滑膜关节进行机械刺激，引起机体合成代谢反应。本课题组前期研究显示，在股骨头坏死的动物模型中，机械加载可通过上调VEGF 的表达促进血管生成，同时增加血液灌注以加强股骨头血管重塑和骨伤口的愈合［5］。但有关机械加载对受损子宫内膜的修复作用尚不清楚。本研究通过建立乙醇诱导的薄型子宫内膜动物模型，初步探讨机械加载对薄型子宫内膜的修复作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 30 只雌性 SD 大鼠，SPF 级，10～12 周龄，体质量约220～250 g，由中国人民解放军军事医学科学院动物中心提供。所有实验动物的饲养和管理遵守天津医科大学实验动物管理规定，本研究经天津医科大学伦理委员会批准。

1.1.2 主要试剂及仪器 95%乙醇购自天津致远化学试剂公司。青霉素购自美国Invitrogen 公司。苏木素-伊红（HE）染色液购自北京索莱宝公司。细胞增殖核抗原（Ki-67）一抗购自美国Abcam 公司。VEGF 一抗购自武汉Proteintech 公司。二抗（生物素标记山羊抗兔抗体）、磷酸盐缓冲液（PBS）及二氨基联苯胺（DAB）等其他化学品购自北京中杉金桥生物有限公司。石蜡切片机购自德国Leica公司产品。光学显微镜购自日本OLYMPUS公司。机械加载治疗仪器为本课题组自主研发（中国专利号：ZL 2016 2 1010131.9）。

1.2 方法

1.2.1 阴道涂片动物适应性喂养1周后开始进行实验。每日上午8：00—9：00做大鼠阴道涂片检查。用蘸有生理盐水的棉拭子取出阴道分泌物涂在玻片上，自然干燥后在显微镜下直接观察。或者玻片干燥后用95%乙醇固定后进行常规HE染色。通过镜下观察阴道脱落细胞形态学变化确定大鼠动情周期的各阶段，并详细记录变化规律。

1.2.2 动物分组采用随机数字表法将30只大鼠分成假手术组（Sham组），薄型子宫内膜模型组（TE组）和机械加载治疗组（TE+L组），每组10 只。Sham组宫腔注射生理盐水，TE组宫腔注射95%乙醇建立薄型子宫内膜模型，TE+L组造模次日接受机械加载治疗，连续治疗3个动情周期即15 d。

1.2.3 模型制备取处于动情期的雌性SD 大鼠，2.5%异氟烷吸入麻醉，仰卧位固定，正中逐层切开腹部，暴露一侧子宫，用0号缝合丝线活结结扎子宫两端，见图1。用1 mL注射器将0.3 mL 的95%乙醇缓慢注入宫腔内，保持宫腔充盈状态，2 min 后再注射0.1 mL，连续2 次，另一侧子宫同样处理。反复冲洗宫腔，恢复子宫解剖位置，逐层关腹缝合［6］。对于Sham组，宫腔注入等量的生理盐水。术后连续肌内注射青霉素（80万U/只）3 d，预防感染。

Fig.1 The schematic diagram of uterine exposure and ligation in rats图1 大鼠子宫暴露和结扎图示

1.2.4 机械加载治疗 2%异氟烷以1.0～1.5 L/min 的流速对TE+L组大鼠诱导麻醉后，采用本课题组自主研发的小动物关节机械加载治疗仪进行治疗。将大鼠膝关节外侧、内侧置于加载杆和定子之间，加载力由外侧向内侧施加到关节上，见图2。加载频率为15 Hz，力度为5 N，时间为5 min/d［5］，连续治疗3个动情周期即15 d。Sham组和TE组大鼠用相同的方法被麻醉和固定，但不接受机械加载治疗。

Fig.2 The schematic diagram of mechanical loading for rats图2 大鼠机械加载图示

1.2.5 病理组织形态学观测 3组动物子宫组织取材后，标本经4%多聚甲醛固定48 h，石蜡包埋，5µm组织切片。每只大鼠分别取3 张切片进行常规HE 染色，光学显微镜下观察子宫内膜组织病理形态学改变，采用OLYMPUS cell Sens Standard 图像处理软件测定子宫内膜厚度（子宫内膜肌层交接处至宫腔的垂直距离）和子宫内膜面积。此外，在40倍镜下计数视野内子宫内膜腺体的数目。

1.2.6 免疫组织化学法检测子宫组织VEGF 和Ki-67 的表达石蜡切片经37 ℃烘片过夜，梯度乙醇水化，PBS 冲洗3 min×3次，微波抗原修复3 min×2次。每张切片滴加3%H2O2室温孵育15 min，PBS冲洗3 min×3次。封闭用血清工作液孵育15 min，甩去切片表面的封闭液（勿洗）。滴加稀释好的一抗（VEGF和Ki-67稀释浓度均是1∶200）4 ℃过夜，PBS冲洗3 min×3 次。滴加二抗工作液孵育15 min，PBS 冲洗3 min×3次。辣根过氧化物酶标记链霉卵白素工作液孵育15 min，PBS 冲洗 3 min×3 次，DAB 显色，自来水冲洗 3 min。苏木素复染15 min，PBS 返蓝4 min，梯度乙醇水化，中性树胶封片。VEGF 和Ki-67 蛋白表达分别位于细胞质和细胞核中，呈现明显棕黄色颗粒为阳性细胞。每张切片随机选择5个400倍视野，计算视野内VEGF 和Ki-67 阳性表达率=阳性细胞数/观察细胞数×100%，分别反映子宫内膜血管生成和细胞增殖情况［7-8］。

1.3 统计学方法采用SPSS 21.0 进行数据统计的处理，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析（ANOVA），组间多重比较行LSD-t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠动情周期各阶段的阴道涂片动情前期阴道涂片主要为圆形或椭圆形的有核上皮细胞，偶有少量角化上皮细胞；动情期多为无核角化上皮细胞，外形不规则呈落叶状聚集分布；动情后期小而圆的白细胞开始增多，有核上皮细胞和无核角化细胞同时存在，并且比例无明显的差异；动情间期阴道涂片的主要特征是白细胞，见图3、4。

2.2 机械加载对子宫内膜组织病理学变化的影响 HE染色结果显示，Sham组子宫内膜结构完整，呈波浪形，腺上皮及腔上皮细胞形态正常，排列紧密呈单层立方状，间质无水肿，血管和腺体正常。与Sham组相比，TE组子宫壁全层变薄，子宫内膜层最显著，宫腔内可见脱落的组织碎片，子宫内膜结构有缺失不连续，腺上皮及腔上皮细胞多呈现扁平状，腺体明显减少，间质部分水肿，血管分布稀疏。经过机械加载治疗后，TE+L组子宫可见大部分完整宫腔结构，内膜有一定的波浪形，大部分腺上皮及腔上皮细胞完整，分布均匀，排列紧密呈单层立方状，腺体增多，血管分布密度集中，病理变化与TE组相比明显改善，见图5。

2.3 机械加载对子宫内膜厚度、子宫内膜面积和腺体数目的影响与Sham组相比，TE组子宫内膜明显萎缩变薄，子宫内膜面积减少，腺体数目显著下降（均P＜0.05）。与TE组相比，TE+L组子宫内膜的厚度明显增厚，子宫内膜面积增加，腺体数目显著增多（均P＜0.05），见表1。

2.4 机械加载对子宫内膜中VEGF表达的影响免疫组化VEGF染色结果显示，VEGF主要表达在子宫内膜上皮细胞和间质细胞胞质中；与Sham组相比，TE组VEGF在子宫内膜上皮细胞和间质细胞中的阳性表达率明显降低（P＜0.05），经机械加载治疗后，TE+L组VEGF 在子宫内膜上皮细胞和间质细胞中的阳性表达率较TE组显著升高（P＜0.05），见图6、表2。

Fig.5 Morphological changes of rat endometrium（HE staining）图5 大鼠子宫内膜的形态学变化（HE染色）

Tab.1 Comparison of endometrial thickness,endometrial area and gland number between three groups表1 各组子宫内膜厚度、子宫内膜面积和腺体数目的比较（n=10，±s）

＊P＜0.05；a与Sham组比较，b与TE组比较，P＜0.05

组别Sham组TE组TE+L组F子宫内膜厚度（µm）535.84±61.23 245.13±51.62a 321.82±59.19ab 68.679＊子宫内膜面积（mm2）1.78±0.48 0.76±0.19a 1.09±0.21ab 25.666＊腺体数目（个）20.10±6.21 4.50±1.27a 8.10±1.29ab 47.872＊

2.5 机械加载对子宫内膜中Ki-67表达的影响免疫组化Ki-67染色结果显示，Ki-67主要表达在子宫内膜腺上皮细胞和间质细胞胞核中；与Sham组相比，TE组Ki-67 在腺上皮细胞和间质细胞中的阳性表达率明显降低（P＜0.05）。经机械加载治疗后，TE+L组Ki-67 在腺上皮细胞和间质细胞中的阳性表达率较TE组显著升高（P＜0.05），见图7、表2。

Tab.2 Comparison of positive expressions of VEGF and Ki-67 in endometrium between three groups表2 各组子宫内膜中VEGF和Ki-67阳性表达率的比较（n=10，%，±s）

＊P＜0.05；a与Sham组比较，b与TE组比较，P＜0.05

组别Sham组TE组TE+L组F VEGF 39.61±11.03 20.59±4.58a 27.63±5.42ab 16.125＊Ki-67 25.72±6.11 12.48±3.88a 18.43±3.83ab 19.643＊

3 讨论

近年来，不孕症已成为困扰女性生殖健康的世界性问题，辅助生殖技术的迅速发展为解决这一难题提供了有效的途径，但胚胎移植成功率仍限制在20%～30%。薄型子宫内膜已经成为体外受精-胚胎移植中周期取消和种植失败的常见原因，直接导致子宫内膜容受性下降，影响临床妊娠率［9］。目前，薄型子宫内膜的常规治疗方式是联合用药，但药物治疗存在较多的不良反应，且患者的依从性较差［4］。本实验通过建立薄型子宫内膜动物模型，从运动康复的角度初步探讨机械加载对薄型子宫内膜的修复作用。

3.1 运动康复在女性生殖疾病中的运用物理康复训练是女性生殖系统疾病的重要治疗手段。研究发现，运动训练能改善排卵功能异常患者的卵巢功能，调节雌孕激素水平，改善子宫微环境，有助于子宫内膜生长［10］。此外，瑜伽运动能减少子宫血流血管的阻力，增加子宫血液灌注，改善子宫缺血的状态，从而减轻痛经症状［11］。脉冲式机械加载作为一种模拟人体主动运动的新型物理康复治疗方式，以一定频率对滑膜关节进行机械刺激从而产生治疗作用。研究表明，机械加载可以刺激血管生成，抑制炎症反应，调节子宫内膜干细胞的分化功能［12-13］。与传统的运动康复训练相比，其能够更好地帮助身体残疾或制动的患者进行主动物理运动，达到治疗的作用。

3.2 机械加载对薄型子宫内膜的疗效本研究采用95%乙醇宫腔内注射能较好地复制薄型子宫内膜模型。造模后大鼠子宫内膜损伤明显，子宫内膜层萎缩变薄，内膜面积缩小，腺体数量减少，血管分布稀疏，间质部分水肿，宫腔失去原有完整结构，与之前Jang 等［14］研究结果基本一致。不同之处在于，本实验采用许春燕等［6］的改良方法进行造模，将血管夹替换成压强较小的0号丝线进行活结结扎子宫两端，避免了对子宫的强烈刺激，减少实验误差，使其符合临床相关症状。本研究结果显示，施加机械加载干预后，能明显增加薄型子宫内膜的厚度，增加内膜面积，恢复腔上皮和腺上皮细胞的正常结构，减轻间质水肿，促进内膜腺体和毛细血管的生成，提示机械加载能够改善子宫内膜组织的病理损伤，缓解薄型子宫内膜的病程发展。

3.3 机械加载对血管生成和细胞增殖的作用子宫内膜的血管生成和细胞增殖相互依赖、互相促进，是子宫内膜有效修复再生、为胚胎植入提供良好子宫内膜微环境的两个关键性因素。VEGF 被认为是调控子宫内膜新生血管形成的重要因子，可增加子宫内膜血管通透性及血管化，通过调节子宫内膜微环境促进胚胎植入［15］。VEGF 与薄型子宫内膜关系密切，VEGF 低表达会抑制血管的生成，子宫内膜血供减少，影响子宫内膜的增殖和修复，从而导致子宫内膜容受性降低［3］。本研究结果显示，与Sham组相比，TE组的VEGF阳性表达率明显降低；经过机械加载治疗后，TE+L组的VEGF阳性表达率明显高于TE组，提示机械加载通过上调VEGF 的表达促进血管生成，增加子宫血液灌注，促进子宫内膜再生。Ki-67是一种增殖细胞相关的核抗原，其功能与有丝分裂密切相关，被认为是细胞增殖的重要标志物，能够客观地反映出子宫内膜细胞增殖的程度［16］。本研究结果显示，TE+L组Ki-67 阳性表达率明显高于TE组，提示机械加载能通过上调Ki-67 的表达促进子宫内膜细胞增殖，修复损伤的子宫内膜组织。以上结果表明机械加载可能通过促进子宫内膜的血管生成和细胞增殖，从而修复薄型子宫内膜，但其具体机制尚有待于进一步研究。

3.4 不足与展望既往治疗薄型子宫内膜的药物作用有限，效果不确切。因此，找到一种安全有效的治疗方式是目前面临的一大挑战。本研究结果表明，机械加载对大鼠薄型子宫内膜有明显修复作用，该作用可能与机械加载促进子宫内膜的细胞增殖和血管生成有关。这一研究为机械加载的物理康复治疗和临床应用提供了实验依据。然而，机械加载治疗薄型子宫内膜的具体作用机制仍需进一步研究。