徐晋峰，李心乐，2，刘大全，2，张平，2△

心肌梗死（心梗）是心血管疾病中常见的危重症，严重威胁人类生命健康。我国近十年心肌梗死病死率整体呈上升趋势，心血管病已成为全国首位死亡原因［1］。心梗发生后，损伤组织发生细胞和分子水平的氧化应激，强烈的炎症反应，心肌细胞凋亡、坏死和纤维化等复杂的变化，从而引起心室重构，最终导致心力衰竭［2］。心室重构在心梗发生后数小时就已开始，并可持续数周甚至数月，心梗后的炎症反应在心室重构过程中起着重要的作用［3］。

除传统的药物干预和介入治疗外，运动康复已成为心梗治疗中心脏康复的关键环节。研究发现，心梗后早期适宜的运动康复训练有助于减轻炎症反应、抑制心肌纤维化、逆转心室重构［4］。本课题组自主研发的脉冲式机械加载是一种模拟主动有氧运动的物理康复疗法。前期研究表明，机械加载通过对骨和滑膜关节产生机械应力作用达到机体主动物理运动的效果，已证实其可以在一定程度上降低机体的炎症反应［5］。笔者近期实验还表明，机械加载可以有效改善高脂饮食导致的肥胖和脂肪肝［6］。但有关机械加载改善心梗大鼠心肌损伤的作用尚鲜见报道。因此，本研究通过建立心肌梗死大鼠模型，探讨机械加载是否可改善心肌损伤，并从炎症反应和心室重构的角度探讨其可能的病理机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 健康雄性Wistar大鼠48只，8周龄，体质量200 g 左右，购于中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心。实验动物的饲养和管理过程均严格遵守天津医科大学实验动物管理规定。本研究经天津医科大学伦理委员会批准。

1.1.2 主要仪器和试剂 BL-420S 生物机能实验系统购自成都泰盟有限公司。机械加载仪器使用自主研发并制作的产品（专利号：ZL201621010131.9）。RM2255 轮转式切片机（德国Leica公司）、光学显微镜BX53（日本Olympus公司）、动物呼吸机（上海奥尔科特生物科技有限公司）、SF-400电子称（永康市转金工贸有限公司）、电子天平（美国Mrttler Toledo公司）、核因子-κB p65（nuclear factor-κb p65，NF-κB p65）、白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）和基质金属蛋白酶-9（matrix metalloproteinase 9，MMP-9）多克隆抗体（美国Cell Signaling Technology）。

1.2 方法

1.2.1 动物分组和造模 实验前48 只Wistar 大鼠按随机数字表法分成2组（模型组38只，假手术组10只）。模型组术中结扎冠脉左前降支，术后48 h存活20只；假手术组（Sham）术中只穿线不结扎，术后10只全部存活。将存活模型组大鼠按随机数字表法分成心肌梗死（MI）组和心肌梗死机械加载治疗（MI+L）组，每组10 只。实验前大鼠在安静环境下饲养2 d，术前禁食12 h，自由饮水。2%异氟烷吸入麻醉，用针灸针分别刺入大鼠双上肢及双下肢末端皮肤，连接至BL-420S生物信号采集处理系统进行心电监护，监测Ⅱ导联ST 段（图1A）。将大鼠进行气管插管，连接啮齿动物呼吸机，调节呼吸机潮气量为3 mL/100 g 和呼吸频率55～65 次/min；用棉絮置于管口，可见棉絮规律飘动，证明气管插管成功（图1B）。在第3、4肋间皮肤做一长约3～4 cm横切口，依次分离胸大肌和肋间肌，放置开胸器，用镊子提捏心脏表面，剥开心包膜，模型组大鼠于左心耳与肺动脉圆锥交界处用5-0 丝线结扎冠脉左前降支，宽1 mm、深1 mm（图1C箭头所示），假手术组在手术中只穿线不结扎。手术成功标准为肉眼可见心尖部及左室前壁由肉红色变为苍白色且心脏搏动减弱；造模后30 min 心电图可见Ⅱ导联 ST 段弓背向上抬高≥0.1 mV［7］。挤压胸腔排除气体，用2-0 丝线逐层缝合肋骨、胸大肌、皮肤，术后保温，待生命体征平稳后撤呼吸机，恢复自主呼吸。

Fig.1 The schematic diagram of myocardial infarction modeling for a rat图1 大鼠心肌梗死造模图示

1.2.2 机械加载治疗 实验动物心梗造模成功1 d后，MI+L组进行膝关节机械加载治疗。2%异氟烷吸入诱导麻醉后，仰卧位将大鼠膝关节外侧、内侧置于加载杆和定子之间，松紧适宜，进行膝关节机械加载（图2）。加载频率为15 Hz，加载力度5 N，时间6 min，每侧膝关节3 min，每周连续加载5 d，连续加载2周［8-10］。Sham组和MI组动物放置在加载平台，仅接受麻醉而不进行膝关节机械加载治疗。

Fig.2 The schematic diagram of mechanical loading for a rat图2 大鼠机械加载图示

1.2.3 标本取材、组织学观察和分析 机械加载治疗结束24 h后，禁食不禁水12 h，记录体质量（body weight，BW）。大鼠麻醉后，连接至BL-420S生物信号采集处理系统进行心电监护，记录Ⅱ导联ST 段，之后在胸主动脉处插入灌注针头，下腔静脉注射10%KCl 3 mL 使心脏停跳于舒张期。然后剪开右心耳，快速均匀地推入肝素生理盐水，待右心耳流出液明显变浅，换成4%多聚甲醛灌注约300～400 mL，然后去除大血管及结缔组织，滤纸吸干，称心脏质量（heart weight，HW），计算心脏质量指数（HMI；HW/BW）；分离大鼠胫骨测量长度（tibial length，TL），计算心脏质量/胫骨长度。将心脏置于4%甲醛中固定，48 h后脱水、透明、石蜡包埋，心脏经横断面 5 µm 连续切片，行常规HE 染色和 Masson 染色。HE 染色后每张切片于梗死边缘区随机选取5 个高倍镜视野（×200），计数炎性细胞并取平均值，反映炎症水平及心肌损伤程度。Masson染色后观察心肌形态和心肌纤维化，计算胶原容积分数（collagen volume fraction，CVF）；CVF=［视野下Ⅰ/Ⅲ型胶原面积/（Ⅰ/Ⅲ型胶原面积+心肌组织面积）］×100%。心脏取材后放入-20 ℃低温冰箱冰冻30 min，取出心脏后沿左心室长轴将心脏均匀切成厚度约1～2 mm 切片，将切片置于1%TTC染色液中，37 ℃避光保温15 min，不断翻动组织，保证组织浸泡于染色液中。染色结束后蒸馏水冲洗，可见心肌梗死区呈灰白色，非心肌梗死区呈深红色，数码相机连续拍照，用图像处理软件（Image-Pro Plus）计算梗死范围（myocardial infarction size，MI size）和左室舒张末内径（LVEDD）。梗死范围=［（疤痕外周弧长+疤痕内周弧长）/（左心室截面外周长+左心室截面内周长）］×100%。余下的心脏标本沿房室交界处剪去左右心房及大血管，去除右心室游离壁，称取余下的左心室质量（left ventricular mass，LVM），记录并计算左心室质量指数（left ventricular mass index，LVMI；LVM/HW），用于评价左心室肥厚程度［11］。

1.2.4 心肌组织 NF-κB p65、IL-6 和 MMP-9 免疫组织化学染色 上述石蜡切片经37 ℃过夜，梯度乙醇水化，PBS冲洗3次，微波修复2 min×3 次，每张切片滴加3%H2O2室温孵育15 min，封闭用血清工作液孵育15 min，滴加一抗4 ℃过夜，二抗工作液孵育15 min，辣根过氧化物酶标记链霉卵白素工作液孵育15 min，滴加DAB 液同步显色，中性树胶封片。NF-κB p65、IL-6 和MMP-9 位于细胞核和细胞浆中，出现明显棕黄色颗粒为阳性细胞。在高倍镜下（×200）对每个病变组织随机选5个视野进行阳性细胞计数并取平均值，分析心肌组织NF-κB p65、IL-6和MMP-9阳性指数（positive index，PI）。PI（%）=阳性细胞数/视野所有细胞总数×100%［12］。

1.3 统计学方法 采用SPSS 19.0 统计软件进行分析，符合正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间均数比较采用单因素方差分析（ANOVA），组间多重比较采用LSD-t检验。通过Pearson 相关系数检验进行参数的相关分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 机械加载降低心梗大鼠Ⅱ导联ST 段水平 造模前大鼠心电图Ⅱ导联ST 段正常（图3A 箭头所示），造模后30 min 心梗大鼠心电图Ⅱ导联ST 段明显抬高，表明心肌梗死造模成功；治疗2 周后，与MI组相比，MI+L组Ⅱ导联ST段抬高幅度显著降低，见图3。将Ⅱ导联ST 段量化后结果表明，造模后30 min ST 段较造模前抬高幅度明显增加（P＜0.01），MI+L组ST段抬高幅度较MI组显著减低（P＜0.01），见表1。

2.2 机械加载改善心梗大鼠炎性反应 HE染色结果可见，Sham组大鼠心肌组织中心肌细胞染色清晰，排列整齐，肌纤维走行方向一致，胞核清楚，位于细胞中央。MI组心肌组织可见典型的心肌梗死病理改变，梗死区坏死的心肌细胞消失，内皮细胞、成纤维细胞增多，并伴有白细胞、巨噬细胞等炎性细胞浸润，坏死区域扩大，形成瘢痕组织，梗死边缘区细胞间隙增宽、断裂、水肿，坏死范围与正常组织边界不清。MI+L组心肌梗死病理改变较MI组减轻，梗死区仍可见少量心肌细胞，散在炎性细胞，坏死区域及瘢痕组织较MI组小，梗死边缘区比MI组稍清晰，见图4。经2 周机械加载治疗后，MI+L组心肌炎症细胞浸润数量较MI组减少（P＜0.01），见表2。

2.3 机械加载降低心梗大鼠心肌纤维化和梗死范围 Masson染色结果显示，Sham组正常肌纤维呈红色，胶原纤维呈蓝色，心肌组织细胞排列整齐，胶原纤维较少且分布正常。MI组可见典型的胶原纤维过度增生，并向梗死边缘区延伸。MI+L组梗死区心肌组织细胞排列较MI组整齐，胶原纤维较MI组减少，纤维化程度降低，见图5。TTC染色结果显示，正常心肌组织呈鲜红色，梗死心肌呈苍白色，见图6。与 Sham组相比，MI组心肌 CVF 增加、梗死范围扩大；MI+L组较MI组心肌CVF明显降低、梗死范围缩小（P＜0.05），见表2。

2.4 机械加载缓解心梗大鼠心室重构 结果显示，与Sham组相比，MI组心肌LVEDD（图6箭头所示）、HMI、LVMI 和心脏质量/胫骨长度显著增加，经过机械加载治疗后显著降低（P＜0.05），见表3。

Fig.3 The schematic diagram of the lead ⅡST-segment of electrocardiogram图3 大鼠心电图Ⅱ导联ST段图示

Tab.1 The comparison of the lead ⅡST-segment of electrocardiogram between three groups表1 大鼠心电图Ⅱ导联ST段比较 （n=10，mV，±s）

Tab.1 The comparison of the lead ⅡST-segment of electrocardiogram between three groups表1 大鼠心电图Ⅱ导联ST段比较 （n=10，mV，±s）

＊＊P＜0.01；a与Sham组比较，b与MI组比较，P＜0.05

组别Sham组MI组M+L组F造模前0.060±0.011 0.053±0.019 0.061±0.018 0.601造模后30 min 0.059±0.015 0.320±0.041a 0.319±0.059a 127.646＊＊造模后2周0.051±0.021 0.154±0.022a 0.110±0.019ab 63.382＊＊

Tab.2 The comparison of the number of inflammatory cells,collagen volume fraction and MI size between three groups表2 各组大鼠炎性细胞数量、CVF和梗死范围比较（n=10，±s）

Tab.2 The comparison of the number of inflammatory cells,collagen volume fraction and MI size between three groups表2 各组大鼠炎性细胞数量、CVF和梗死范围比较（n=10，±s）

＊＊P＜0.01；a与Sham组比较，b与MI组比较，P＜0.05

组别Sham组MI组MI+L组F炎性细胞数（个/视野）0 61.10±11.76a 47.40±11.25ab 116.142＊＊CVF（%）6.01±1.43 37.02±9.10a 30.92±5.68ab 69.065＊＊梗死范围（%）0 27.93±6.40a 21.91±2.97ab 131.397＊＊

Tab.3 The comparison of LVEDD,HMI,LVMI and heart weight/tibial length between three groups表3 各组大鼠LVEDD、HMI、LVMI和心脏质量/胫骨长度的比较 （n=10，±s）

Tab.3 The comparison of LVEDD,HMI,LVMI and heart weight/tibial length between three groups表3 各组大鼠LVEDD、HMI、LVMI和心脏质量/胫骨长度的比较 （n=10，±s）

＊＊P＜0.01；a与Sham组比较，b与MI组比较，P＜0.05

组别Sham组MI组MI+L组F LVED（mm）2.76±0.36 7.34±1.04a 4.59±0.89ab 79.599＊＊HMI（mg/g）3.61±0.30 4.48±0.24a 3.98±0.23ab 28.286＊＊LVMI（mg/g）2.24±0.07 2.85±0.17a 2.61±0.08ab 71.823＊＊心脏质量/胫骨长度（g/cm）0.34±0.02 0.41±0.02a 0.38±0.03ab 26.474＊＊

2.5 心肌组织 NF-κB p65、IL-6 和 MMP-9 蛋白表达 免疫组化染色结果显示，Sham组心肌细胞仅有少量 NF-κB p65、IL-6 和 MMP-9 表达，MI组 3 种蛋白表达显著升高；经加载治疗后MI+L组3种蛋白表达较MI组明显降低（P＜0.01），见图6、表4。

Fig.6 Changes of infarct size and LVEDD diameter in three groups(TTC staining)图6 各组大鼠梗死范围与左室舒张末内径观察（TTC染色）

Tab.4 The comparison of positive index of NF-κB p65,IL-6 and MMP-9 between three groups表4 各组大鼠NF-κB p65、IL-6和MMP-9蛋白阳性指数比较 （n=10，%，±s）

Tab.4 The comparison of positive index of NF-κB p65,IL-6 and MMP-9 between three groups表4 各组大鼠NF-κB p65、IL-6和MMP-9蛋白阳性指数比较 （n=10，%，±s）

＊＊P＜0.01；a与Sham组比较，b与MI组比较，P＜0.05

组别Sham组MI组MI+L组F NF-κB p65 6.01±0.96 38.25±5.88a 32.55±5.53ab 133.902＊＊IL-6 7.08±2.05 42.27±5.59a 33.22±5.71ab 147.189＊＊MMP-9 7.07±1.51 35.89±4.20a 29.05±5.37ab 139.513＊＊

2.6 大鼠心肌组织炎症因子及与心室重构指标的相关性分析 结果表明，NF-κB p65与IL-6、MMP-9表达呈正相关（r分别为0.559、0.933，P＜0.01），IL-6与MMP-9 表达呈正相关（r=0.937，P＜0.01）。炎症因子与心室重构指标（LVEDD、HMI、LVMI和心脏质量/胫骨长度）均呈正相关，见表5。

Tab.5 Correlation analysis between NF-κB p65,IL-6 and MMP-9 with LVEDD,HMI,LVMI and heart weight/tibial length表5 NF-κB p65、IL-6和MMP-9与LVEDD、HMI、LVMI和心脏质量/胫骨长度相关性分析 （n=10，r）

3 讨论

3.1 机械加载对心肌组织炎症反应的影响 本研究采用结扎冠状动脉左前降支制作心肌梗死模型，通过监测心电图，笔者观察到Ⅱ导联ST 段明显升高，证明心肌梗死诱导成功。通过机械加载治疗后，心梗造成的Ⅱ导联ST 段升高有所改善。本研究发现，2 周的机械加载治疗使心梗大鼠心肌组织中炎症细胞数量降低，同时使NF-κB p65和IL-6的表达明显下降，提示机械加载能够有效抑制炎症细胞浸润和降低炎症因子NF-κB p65和IL-6的分泌水平，增强心梗后心肌抗炎能力，从而改善心室重构。心梗后的炎症反应贯穿心梗的发生发展整个病理过程，同时也是引起心室重构的关键因素［13］。心梗后早期炎症反应造成的心肌损伤已被广泛认同，早期炎症细胞分泌大量炎症因子，如IL-6，IL-1β和肿瘤坏死因子（TNF）-α 等［14］，可对心肌细胞产生直接的毒性作用，加速心肌细胞的凋亡。IL-6是一种重要的促炎细胞因子，心梗后IL-6 的表达水平显著升高［15］。研究表明，减轻由IL-6介导的炎症反应可以改善心梗后不良的心室重塑［16］。NF-κB 参与包括免疫反应、肿瘤、细胞凋亡等许多生理、病理过程，也是炎症基因调控中心，在冠心病中起到重要作用。NF-κB p65 是NF-κB 家族一个重要的亚单位，是炎症信号通路的分子“开关”。炎症免疫反应可以激活NF-κB 并促进产生一系列炎症因子［17］；同时，炎性因子如IL-6 又可以激活NF-κB 诱导相关炎症因子表达，从而形成一个级联反应，导致炎症相关因子过度表达［18］。本研究发现，机械加载抑制心梗后心肌组织NF-κB p65和IL-6的蛋白表达，且相关性分析提示两者表达呈正相关，表明机械加载对心梗后炎症反应的治疗作用可能与抑制NF-κB 活化和降低IL-6表达有关，但加载治疗后IL-6表达的降低是否与抑制NF-κB活化有关，其相关机制还需进一步研究。

3.2 机械加载对心室重构的影响 心梗后心室重构是一个复杂的病理生理过程，包括心肌细胞丢失、心肌细胞变长、心室壁变薄、心肌肥厚和胶原沉积等，导致心室大小和功能的改变，最终出现左室功能不全，甚至心衰［19］。本实验通过记录并分析MI大鼠LVEDD、HMI、LVMI、心脏质量/胫骨长度和 CVF 的结果，同时检测MMP-9 的蛋白表达，探讨机械加载对MI后心室重构的相关影响。MMPs家族是一种依赖于锌离子的内切蛋白水解酶家族，在心室重构过程中发挥了关键性作用，参与细胞外基质的降解与胶原合成的调节，表达增高会导致细胞外基质纤维化和胶原沉积［20］。MMP-9 是 MMPs 家族中的重要成员。本实验中，各组大鼠实验前体质量无差异，2周后MI组大鼠的 LVEDD、HMI、LVMI、心脏质量/胫骨长度和CVF较Sham组增加，提示心梗后发生心室重构，可能是由于心梗后缺血的心肌造成局部心肌细胞肥大、胶原沉积、间质纤维化等相关；而经过机械加载后MI+L组与MI组相比上述指标显著下降，表明机械加载能够缓解心室重构，抑制心肌纤维化，改善心功能。心梗后大鼠心肌细胞中MMP-9 蛋白表达升高，表明心梗后早期MMP-9 即被激活，并且在随后的心室重构期间持续表达，从而降解细胞外基质，促进胶原沉积和纤维化。相关性分析显示MMP-9与NF-κB的表达呈正相关，表明机械加载对心梗后心室重构的治疗作用可能与抑制NF-κB 活化和降低MMP-9 表达有关，但加载治疗后MMP-9表达的降低是否与抑制NF-κB 活化有关仍需进一步研究。NF-κB p65、IL-6 和 MMP-9 与 LVEDD、HMI、LVMI 和心脏质量/胫骨长度均呈正相关，提示心梗后心室重塑的改善与炎症反应程度降低有关，其相关机制仍需进一步研究。

3.3 心梗后运动康复的研究现状 心脏康复作为心梗治疗中的重要辅助手段，现已逐渐被大众所认识和接受。运动康复作为心脏康复的核心内容，在心脏康复中的地位越来越重要。过去认为为了减少心肌耗氧量，减轻心脏负担，急性心梗后的急性期应绝对卧床休息，从而预防并发症的发生。然而，近年来研究发现，急性心梗患者依据个体情况早日进行运动康复，有利于心肌修复［21］。心梗后进行适宜强度的有氧运动可降低心梗患者病死率，减轻心肌炎症反应和降低TNF-α、IL-6 和IL-1 等炎症因子表达，减少心肌纤维化，改善心室重构，有效预防心力衰竭［14］。机械加载作为一种模拟人体主动运动的新型物理康复治疗方式，以生理性、温和的频率对关节进行机械刺激从而产生治疗作用［22］。已证明机械加载可以降低机体的炎症反应［5］。相比传统的运动康复训练，机械加载能够更好地帮助不能从事体力活动的患者进行主动物理运动，起到康复的作用，为心肌梗死运动康复提供新的治疗策略。

3.4 不足与展望 目前我国心脏运动康复处于起步阶段，大大落后于心血管临床治疗技术的发展。因此，找到一种有效的治疗手段是目前所面临的挑战。本实验表明，机械加载可通过减轻心梗后炎症反应和心室重构来改善心梗后心肌损伤，为机械加载对心梗的物理康复治疗和临床应用提供了实验依据。然而，机械加载修复心梗后心肌损伤的机制还需进一步研究与探讨。

Fig.4 Observation of inflammatory cells in heart of rats under light microscopy in three groups(HE staining,×200)图4 光镜下观察各组大鼠心脏炎性细胞（HE染色，×200）

Fig.5 Changes of myocardial fibrosis under light microscopy in three groups(Masson staining,×200)图5 光镜下观察各组大鼠心肌纤维化（Masson染色，×200）

Fig.7 Changes of protein expressions of NF-κB p65,IL-6 and MMP-9 in myocardial cell under light microscopy in three groups(immunohistochemistry staining,×200)图7 光镜下观察各组大鼠心肌细胞NF-κB p65、IL-6和MMP-9蛋白表达（免疫组化染色，×200）