李敏敏，李宽,2，孙昕,2，吴琦,2，陈怀永,2△

气道上皮黏膜由多种细胞组成，丰度较高的细胞群主要包括纤毛细胞和Club细胞（也称Clara细胞或气道祖细胞）。纤毛细胞特异性表达乙酰化微管蛋白（Acylated tubulin，Act）和叉头框转录因子 J1（Forkhead box J1，FoxJ1），负责清除吸入的颗粒物。Club 细胞特异性表达Clara 细胞分泌蛋白（Clara cell secretory protein，CCSP），此外还分泌多种抗菌物质。气道上皮细胞彼此紧密连接形成肺与外界重要的保护屏障。气道上皮黏膜的异常与慢性阻塞性肺疾病（COPD）和支气管哮喘等多种肺部疾病相关［1-2］。COPD 患者气道上皮黏膜显著增厚，导致气道狭窄和气流受限；而支气管哮喘气道上皮黏膜明显破损，与气道慢性炎症反应的发生发展息息相关［3］。因此，及时而有效地修复气道上皮黏膜损伤对于肺稳态的维持至关重要。研究表明，气道上皮黏膜存在干细胞vClub细胞，其具有分化成Club细胞的潜能。而Club细胞也可分化成纤毛细胞和杯状细胞［4］。杯状细胞特异性表达氯化物通道钙活化家族成员3（Chloride channel accessory 3，Clca3）和叉头框转录因子a3（Forkhead box a3，Foxa3），分泌多种黏液蛋白。在正常情况下，气道上皮黏膜杯状细胞丰度较低，但是在支气管哮喘等肺损伤中丰度增加，是气道黏液增加的主要因素。mTOR信号通路在支气管哮喘中发挥重要作用［5］，有研究表明，mTOR 通过下游分子核糖体蛋白S6 激酶 1（S6K1）促进细胞生存［6］。而S6K1是否调控气道上皮干/祖细胞的再生功能目前尚鲜见研究。本研究采用类器官培养模型研究S6K1 特异性抑制剂 PF-4708671 对小鼠 vClub 和Club细胞增殖与分化功能的影响，明确S6K1信号通路对气道上皮再生的调控作用。

1 材料与方法

1.1 材料 选取健康C57BL/6小鼠10只，8～12周龄，体质量25 g 左右，购自北京华阜康生物科技股份有限公司，饲养于天津市海河医院实验动物中心［许可证号：SYXK（津）2016-0002］。荧光定量 PCR 仪（Light Cycler 96，Roche），酶标仪（Multiskan Go，Thermo），倒置显微镜（Olympus 公司），Trizol试剂购自Invitrogen 公司，逆转录试剂盒购自TIANGEN 生物公司，3D 培养小室购自 Corning 公司，SYBR Green PCR 扩增试剂盒购自Roche 公司，流式抗体CD24-PE、EpCAM-PECyanine、Sca1-APC、CD31-Biotin、CD34-Biotin、CD45-Biotin、Streptavidin APC-eFluor780抗体和7-AAD均购自eBioscience 公司，PF-4708671 购自 Sigma 公司。弹性蛋白酶购自Worthington公司。

1.2 方法

1.2.1 小鼠气道干/祖细胞分离与鉴定 用戊巴比妥钠腹腔注射麻醉C57BL/6小鼠，收集小鼠肺组织，从气管注入弹性蛋白酶进行消化，切碎肺组织，获得肺单细胞悬液。离心后用预冷的汉克平衡盐溶液（Hank's balanced salt solution，HBSS）重悬细胞，加入荧光标记的抗体CD24、EpCAM、Sca-1、CD31、CD34 和 CD45 冰上孵育后，利用流式细胞仪鉴定。vClub 细胞分子表型特征为CD31-CD34-CD45-EpCAM+CD24+Sca-1-，Club细胞为CD31-CD34-CD45-EpCAM+CD24+Sca-1+，后者表达Sca-1，而前者不表达。

1.2.2 类器官培养模型的建立 将分选出来的气道干/祖细胞和小鼠肺成纤维细胞（MLg）混合于Matrigel 基质胶中，然后转移到小室中进行共培养（每个小室接种3 000个vClub细胞或 5 000 个 Club 细胞），将小室置于 24 孔板中，构成 3D 体外气道干细胞类器官培养模型。接种细胞后，在小室下面加上分别含有0、4、20、100 nmol/L PF-4708671的干细胞培养基培养细胞，每2天换液1次，分别设为0、4、20、100 nmol/L PF-470867 处理组，每组5 个复孔。在培养第8 天时用倒置显微镜对克隆拍照并分别统计4组样本的克隆形成数量（直径大于50µm的球状结构）。

1.2.3 荧光定量PCR检测S6K1激酶基因和气道上皮细胞特征分子的表达 在培养到第10天时，用Trizol法裂解气道干/祖细胞并提取总RNA，测定浓度和纯度后，取200 ng 逆转录成 cDNA；逆转录反应体系：10×PCR buffer 5 µL、MgCl215µL、dNTP-Mix 1 µL、Hexamers 1 µL、RNA 酶抑制剂0.5 µL、H2O补足至50 µL。 逆转录条件：25 ℃ 10 min；48 ℃ 40 min；95 ℃5 min；4 ℃恒温。按照RT-PCR反应体系中各种溶液用量配制反应体系，混匀后置于实时定量PCR仪分析目的基因表达量。RT-PCR 扩增体系为 20 µL，包括 cDNA 2.5 µL、SYBR 10µL、上下游引物各0.5µL、H2O 6.5µL。扩增程序：95 ℃ 3 min；95 ℃变性15 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸10 s，循环 45 次。熔解曲线分析：95 ℃ 10 s，65 ℃ 1 min，97 ℃ 1 s，37 ℃30 s。分别检测S6K1激酶基因Rps6kb1和Club细胞标志物Cyp2f2，纤毛细胞标志物Act和Foxj1，杯状细胞标志物Clca3和Foxa3的基因表达情况，以 E-cadherin 作为内参，相关引物由华大基因合成，引物序列见表1。各实验组目的基因的表达量相对于对照组的表达量变化倍数用2-ΔΔCt法计算。

1.3 统计学方法 采用SPSS 16.0 统计软件分析数据，符合正态分布的计量资料采用均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用LSD-t检验；P＜0.05表示差异有统计学意义。

Tab.1 The primers for real-time PCR表1 引物序列

2 结果

2.1 气道干/祖细胞分选与类器官培养模型的建立 流式结果显示，成功分离了vClub 和Club 细胞（图1A～C），上述细胞分别与支持细胞MLg 细胞混合于Matrigel 基质胶里，转入Transwell 小室后置于24孔板上进行3D培养（图1D）。本研究建立这种类器官培养来研究气道上皮干细胞的功能与调控。类器官培养后，vClub 细胞克隆形态是紧缩的球体，Club细胞克隆形态是中空的球体（图1E）。

2.2 PF-4708671 对 vClub 和 Club 细胞中 S6K1 激酶基因的抑制作用 RT-PCR 分析结果显示，与0 nmol/L组相比，20 nmol/L和100 nmol/L 的 PF-4708671 均可抑制 vClub 细胞和 Club 细胞Rps6kb1的mRNA的表达（P＜0.05），但是没有明显剂量依赖性，见表2。

Tab.2 The effect of PF-4708671 on Rps6kb1 expression表2 PF-4708671对Rps6kb1表达的影响 （n=4，±s）

Tab.2 The effect of PF-4708671 on Rps6kb1 expression表2 PF-4708671对Rps6kb1表达的影响 （n=4，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，a与0 nmol/L 比较，b与4 nmol/L 比较，c与 20 nmol/L比较；P＜0.05；各组有1孔数据过大，予以剔除

组别0 nmol/L组4 nmol/L组20 nmol/L组100 nmol/L组F Rps6kb1 mRNA相对表达量vClub 1.04±0.31 0.61±0.45 0.18±0.06a 0.31±0.27a 5.115＊Club 1.02±0.25 0.07±0.03a 0.47±0.15ab 0.04±0.03ac 18.710＊＊

2.3 PF-4708671 对小鼠气道 vClub 和 Club 细胞克隆形成的影响 类器官培养结果显示，不同浓度PF-4708671组间vClub细胞克隆形成数量差异无统计学意义（P＞0.05）。4、20、100 nmol/L PF-4708671浓度组Club细胞克隆形成数量均较0 nmol/L组减少（P＜0.05），但没有剂量依赖性，见表3。

2.4 PF-4708671 对小鼠气道vClub 分化功能的影响 RT-PCR 分析结果显示，4组间vClub 细胞克隆内Cyp2f2mRNA表达水平比较差异均无统计学意义（P＞0.05）。见图2。

Fig.1 Sorting strategy of mouse airway stem/progenitor cells and organoid cultures of these stem/progenitor cells图1 小鼠气道干/祖细胞的分选策略与类器官培养模型

Tab.3 The inhibitory effects of PF-4708671 on colony forming ability of mouse airway vClub cells and Club cells表3 PF-4708671对小鼠气道vClub和Club细胞克隆形成的抑制作用 （n=5，±s）

Tab.3 The inhibitory effects of PF-4708671 on colony forming ability of mouse airway vClub cells and Club cells表3 PF-4708671对小鼠气道vClub和Club细胞克隆形成的抑制作用 （n=5，±s）

＊P＜0.05，a与0 nmol/L组比较，b与4 nmol/L组比较，P＜0.05

组别0 nmol/L组4 nmol/L组20 nmol/L组100 nmol/L组F克隆个数（个/视野）vClub 87±13 84±14 73±6 67±12 2.364 Club 189±24 141±26a 143±28a 151±32a 3.244＊

Fig.2 The effects of PF-4708671 on the differentiation of mouse airway vClub cells图2 PF-4708671对小鼠气道vClub细胞分化功能的影响

2.5 PF-4708671 对小鼠气道Club 细胞分化功能的影响 RT-PCR 分析结果显示，不同浓度的PF-4708671对Club细胞克隆内Foxj1、Act、Clca3和Foxa3的mRNA表达无明显影响，各组间上述特征分子mRNA表达水平差异均无统计学意义，见表4。

Tab.4 The effects of PF-4708671 on the differentiation of mouse airway Club cells表4 PF-4708671对小鼠气道Club细胞分化功能的影响（n=5，±s）

Tab.4 The effects of PF-4708671 on the differentiation of mouse airway Club cells表4 PF-4708671对小鼠气道Club细胞分化功能的影响（n=5，±s）

均P＞0.05

组别0 nmol/L组4 nmol/L组20 nmol/L组100 nmol/L组F纤毛细胞标志物相对表达量Foxj1 1.00±0.05 0.71±0.12 0.99±0.18 1.12±0.35 2.957 Act 1.01±0.15 0.84±0.10 0.99±0.05 0.92±0.20 1.171杯状细胞标志物相对表达量Clca3 1.03±0.26 1.26±0.68 1.31±0.44 1.39±0.27 0.488 Foxa3 1.02±0.25 1.01±0.36 1.21±0.17 1.21±0.41 1.857

3 讨论

气道上皮黏膜是机体与外环境直接接触的第一道屏障，完成气体交换功能的同时，还要抵御外源物质（微生物或有害颗粒及气体）的侵害，所以维持气道上皮的完整性尤为重要［7］。气道上皮黏膜存在干/祖细胞，其中vClub 具有干细胞特性，具有分化成Club细胞的潜能［8］。Club细胞又能分化产生纤毛细胞和杯状细胞［9］。正常情况下，小鼠和人的气道上皮黏膜中vClub 丰度较低，Club 细胞和纤毛细胞的丰度较高。在过敏反应时杯状细胞丰度显著增加。mTOR 是哺乳动物雷帕霉素的靶蛋白，可通过S6K1调控细胞的代谢、增殖、分化和自噬。PF-4708671是S6K1 的抑制剂，可通过抑制S6K1 阻遏mTOR 通路。本研究发现，PF-4708671 能够抑制S6K1 激酶基因Rps6kb1的表达。在vClub细胞中，不同浓度的PF-4708671 对其增殖能力无明显影响。而在Club细胞中，即使低浓度（4 nmol/L）的PF-4708671 也能明显抑制Club细胞的增殖。这很可能是vClub细胞对PF-4708671 的耐受力较高，低浓度的PF-4708671 并不能影响vClub 细胞的增殖能力。说明mTOR/S6K1信号通路促进气道上皮黏膜再生能力。既往研究也发现，在肺动脉平滑肌细胞中利用水杨酸苷阻断mTOR 通路也能够抑制细胞的增殖能力［10］。利用miR-101抑制PI3K/Akt/mTOR通路激活能够显著抑制子宫内膜癌细胞的增殖能力［11］。这与本研究的结果相似，说明在不同的细胞中，mTOR的促增殖功能比较保守。

气道上皮稳态的维持是气道干/祖细胞增殖和分化能力相互协调的结果。气道干/祖细胞分化功能异常时，也会引起气道上皮黏膜损伤。如在支气管哮喘时，杯状细胞增生、分泌增强［12］。在COPD、囊性肺纤维化等疾病中，上皮细胞黏膜功能受到损害将增加感染率和死亡率［13-14］。本研究发现，PF-4708671 处理组与对照组相比克隆形成能力下降，但是Act和Foxj1的表达量没有明显变化，说明PF-4708671 对纤毛细胞的分化影响甚微。此外，PF-4708671处理组与对照组相比Clca3和Foxa3的表达量没有变化，说明对杯状细胞的分化也没有影响，提示S6K1主要是通过调节气道干/祖细胞的增殖功能维持气道上皮黏膜的再生。近来的研究显示，作为S6K1 的上游元件，mTOR 被硫化氢激活后可缓解LPS 诱导的肺损伤［5］。有研究显示 S6K1与 COPD 和支气管哮喘气道平滑肌肥大有关［15-16］。气道上皮细胞缺失mTOR后导致LPS诱导的肺损伤减弱［17］。抑制mTOR调节蛋白可通过增强细胞自噬来减轻高氧引起的肺损伤作用［18］。这可能与mTOR 下游存在S6K1 以外的多个作用靶点有关，另外S6K1 的上游信号也不止mTOR信号。研究不同肺损伤中气道上皮细胞等S6K1 活性的变化对于其病生理机制的揭示至关重要。

综上所述，本研究采用类器官培养模型发现S6K1可能与小鼠气道上皮vClub/Club细胞的增殖功能密切相关，有助于维持气道干细胞的再生能力。与气道干/祖细胞功能低下相关的疾病中，激活S6K1信号通路或许能给临床治疗这些疾病提供新思路。