唐玉蓉 成立峰 于本章

(胜利油田中心医院检验科，东营257000)

胶质瘤是临床备受关注的脑肿瘤之一，是最常见和具有侵袭性的脑肿瘤，发病率占脑和中枢神经系统肿瘤的30%以上。世界卫生组织(World health organization，WHO)据恶性程度将其分为低级别胶质瘤(Ⅰ～Ⅱ级)及高级别胶质瘤(Ⅲ～Ⅳ级)，Ⅱ级胶质瘤患者的中位生存期为5～10年，Ⅲ级肿瘤患者的中位生存期为3～5年。其中高级别胶质瘤高发(占75%以上)且恶性程度高，病情进展迅速并存在较高的复发率[1]。因此，临床上迫切需要早期诊断方法和明确疾病的发生机制。本研究通过检测miR-122在胶质瘤中的表达情况，探讨其在胶质瘤诊断中的作用，以便为胶质瘤的诊疗提供理论依据。同时检测血清中血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)含量，探讨miR-122与VEGF在疾病的发生发展中的作用和意义。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1标本 自2014年4月到2016年4月，在胜利油田中心医院神经外科收集74例胶质瘤患者(胶质瘤组)和74例健康人(对照组)。所有胶质瘤患者均于术前清晨空腹采集3 ml静脉血和5 ml EDTA抗凝血液标本，对照组清晨空腹采集3 ml静脉血和5 ml EDTA抗凝血液标本。3 ml静脉血分离血清后，-20℃保存备用，用于VEGF检测；5 ml EDTA抗凝血在2 h内处理， 1 500 r/min离心10 min。上清液移至无RNA酶的试管，进一步在4℃下以12 000 r/min离心10 min，以除去细胞碎片。将上清血浆在-80℃储存，用于miR-122检测。

1.1.2试剂与仪器 TRIzol试剂(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)，NanoDrop ND1000分光光度计(Thermo Fisher Scientific，Waltham，Mass，USA)，miRcutemiRNAcDNA第一条链合成试剂盒(Tiangen，Beijing，China)，miR-122和U6引物购自GenePharma(中国上海)。ELISA检测试剂盒(注册证编号：鲁械注准20142400165)。

1.2方法

1.2.1RNA提取和定量逆转录PCR 根据试剂操作说明书，使用TRIzol试剂从血浆中提取总RNA。使用分光光度计测定提取的RNA含量和浓度。使用miRcutemiRNAcDNA第一条链合成试剂盒将血浆中的RNA逆转录生成cDNA，并使用miRcutemiRNAqPCR检测试剂盒检测miR-122的表达水平。将U6作为内参。实时定量PCR实验设置3个复孔进行。采用2-ΔΔCt方法进行分析，最终体现为目的基因诱导倍数的差异。

1.2.2ELISA 检测VEGF浓度 严格按照说明书进行操作，通过标准曲线求出标本中VEGF浓度。

图1 miR-122在胶质瘤患者和对照组中的表达Fig.1 miR-122 expression was detected by qRT-PCR in glioma and control groupsNote: Compared with the control group,*.P<0.05.

2 结果

2.1miR-122在血浆中表达 通过qRT-PCR检测血浆中miR-122表达(图1)。结果显示，miR-122在胶质瘤和对照组中的相对定量表达分别为0.68±0.339和1.66±0.550。 miR-122在胶质瘤组中的表达显著降低(P<0.05)。

2.2miR-122对胶质瘤的诊断性能 通过ROC曲线分析miR-122在胶质瘤中的诊断性能。在cut off为1.225时，灵敏度为91.9%，特异度为81.1%，AUC为0.939(图2)。

2.3miR-122与胶质瘤的临床病理特征相关性分析 本研究中miR-122与临床病理特征的相关性列于表1中。根据miR-122中位值(0.61)将胶质瘤患者分为两组：低表达组(<0.61)和高表达组(≥0.61)。miR-122表达与性别、年龄、肿瘤大小或手术切除方法无相关性(P>0.05)，而与WHO分级显著相关。

图2 miR-122对胶质瘤诊断性能的ROC曲线Fig.2 ROC curve for diagnostic performance of miR-122 for gliomas

表1 miR-122 与胶质瘤病理特征相关性分析

Tab.1 Correlation between miR-122 and clinicopatholog-ical features of glioma

ClinicopathologicalfeaturesnmiR-122 expressionLow group(n=37)High group(n=37)PGender0.816Male392019Female351718Age(year)0.816≥50351817<50391920Tumor size0.102<5 cm412417≥ 5 cm331320WHO grade<0.001Ⅰ14014Ⅱ17215Ⅲ20128Ⅳ23230

表2 miR-122和VEGF在对照组和世卫组织Ⅰ～Ⅳ级胶质瘤组中的表达

Tab.2 Expression of miR-122 and VEGF in control group and WHO Ⅰ-Ⅳ grade

WHO gradeⅠⅡⅢⅣControl groupmiR-122 expression1.22±0.161)0.80±0.171)0.59±0.111)0.35±0.111)1.66±0.55VEGF concentration (pg/ml)65.11±6.0870.23±6.21147.85±14.221)176.51±15.711)63.70±6.50

Note：Compared with the control group，1)P<0.05.

2.4miR-122和VEGF在对照组和Ⅰ～Ⅳ级胶质瘤中表达 miR-122和VEGF表达结果如表2所示，与对照组相比，Ⅰ～Ⅳ级miR-122的表达均显著降低。此外，miR-122表达随着胶质瘤的分级增加而降低，具有显著性差异。与对照组相比，Ⅰ～Ⅳ级VEGF浓度随着胶质瘤分级的增加而升高，Ⅲ～Ⅳ升高具有显著性差异。miR-122和VEGF在胶质瘤中的表达呈负相关。

3 讨论

目前，胶质瘤的诊断主要依靠CT和核磁共振，费用昂贵阻碍其成为常规诊断、筛选手段。因此，需要一种便宜、快速、高效的胶质瘤筛选工具。miRNA是一类20～24 nt的小分子RNA片段，其无开放阅读框，不编码蛋白质，但却可通过多种表观遗传调控方式影响细胞增殖、凋亡、分化和侵袭[2]。随着表观遗传与肿瘤关系研究的深入，miRNAs表现出组织特异性表达，可以在癌症中发生显著变化，参与多种恶性肿瘤的发生发展[3]。许多研究已经证明miRNA失调可以作为诊断和预后标记[4-6]。

miR-122是肝脏富含的肿瘤抑制因子，在肝细胞癌中表达受到抑制，靶向WNT1并沉默WNT信号通路，促进肝细胞癌[7]。miR-122在膀胱癌中和乳腺癌中表达也下调[8,9]。最近，Wang等[10]研究发现miR-122通过靶向WNT1抑制Wnt/β-连环蛋白信号通路，抑制胶质瘤细胞增殖和侵袭，其在胶质瘤患者中表达下调。然而，miR-122对胶质瘤诊断的影响尚不清楚。在本研究中，我们分析了胶质瘤患者血浆中miR-122的表达，并评估miR-122在胶质瘤诊断中的作用。

本研究发现与对照组相比，胶质瘤患者血浆中miR-122的表达下调。ROC曲线分析显示miR-122在诊断胶质瘤时敏感度和特异度高。研究表明，血浆miR-122是诊断胶质瘤潜在的生物标志物。此外，miR-122的表达水平与WHO分级显著相关，随胶质瘤的进展而降低。Wang等[10]发现miR-122表达在胶质瘤中下调，表达较高的患者存活率较高。miR-122超表达抑制胶质瘤细胞增殖和侵袭[11]，此结果间接反映了miR-122对胶质瘤的诊断价值。

VEGF是促进肿瘤血管生成的关键刺激因子，几乎参与肿瘤血管生成的每个环节[12]。目前研究表明，较多的实体瘤肿瘤组织高表达VEGF，被认为是恶性肿瘤的主要刺激因子。本研究发现，胶质瘤组的VEGF表达水平比对照组高，Ⅲ和Ⅳ级胶质瘤组的VEGF表达水平与Ⅰ、Ⅱ级胶质瘤组相比显著升高(P<0.05)，说明VEGF不仅在肿瘤瘤体内升高，同样在Ⅲ、Ⅳ级肿瘤患者体内也异常高表达。VEGF在低级别胶质瘤患者中含量较低，与对照组差异无统计学意义，可能与肿瘤细胞早期血管无明显增生相关，所以刺激释放的VEGF水平也偏低。在高级别胶质瘤患者中，部分肿瘤血管异常增生，出现坏死，蛋白释放入血，VEGF浓度升高。此外，本研究发现，miR-122和VEGF之间呈负相关性，验证了随着miR-122的降低，Wnt/β-连环蛋白信号通路受抑降低，胶质瘤细胞增殖和侵袭抑制减弱，促进了肿瘤细胞的增殖，可表现为VEGF浓度增高，加速肿瘤血管形成，肿瘤细胞过度增殖，肿瘤形成。在本研究中，我们发现miR-122表达的最佳截止值为1.225，敏感度为91.9%，特异度为81.1%，AUC为0.939，是神经胶质瘤的潜在诊断生物标志物。为了促进组织特异度和敏感度，我们将在未来的研究中研究miR-122以及其他miRNA或基因用于诊断胶质瘤。miR-122表达的降低，VEGF的升高，为胶质瘤的发生发展提供理论依据，但本研究例数较少，且为单中心研究，故结论需要大样本、多中心的研究来进一步证实。