张子琪 吴 旻 兰海楠 刘惠麟 洪 盼 李若楠 郎伍营 张珊珊 朱凌羽 梁先伟 郑 鑫

(吉林农业大学动物科学技术学院，长春130118)

肠道不仅是消化吸收营养物质的主要器官，同时还是机体内最大的免疫器官。肠道内有大量的驻留细菌，据估计每克组织中含细菌量约为1 014 g。这些细菌是存在于细菌细胞壁中的抗原和促炎分子的重要来源。尽管有这种潜在的免疫刺激，但公认的是肠道中的免疫应答仍处于受控炎症状态[1]。动物的肠道极易受到环境及饮食因素影响进而引发肠道炎症，导致疾病的发生，这在婴幼儿和幼龄动物中尤为明显。炎症性肠病(Inflammatory bowel disease，IBD)就是其中的一种慢性非特异性肠道炎症疾病，它是由环境污染引起(如胃肠道感染，非甾体抗炎药物使用或其他环境毒素)并在遗传易感个体中引发，而后使某些共生细菌的先天性和适应性免疫反应过度活跃的疾病，这一过程可被各种环境因素改变。先天性免疫系统会引发肠道炎症，而适应性免疫反应将导致并维持慢性炎症[2]。虽然IBD的发病机制尚不完全明确，但它的发生与肠道免疫反应的失调和受损的肠上皮细胞反应密切相关[3,4]。

虾青素作为一种天然活性物质能够增强机体肠道黏膜免疫能力，具有强的抗炎、抗氧化性，可预防并降低人类及动物多种疾病的发生和风险[5，6]，现已被美国食品和药物管理局(USFDA)及欧盟委员会批准作为食品添加剂。关于虾青素的研究大都集中在其强大的抗氧化性上，对小肠的炎症影响鲜有报道。为此，本实验以脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)诱导小鼠发生炎症反应，建立体内肠道炎症模型，通过检测炎症因子的分泌和表达量来衡量炎症的严重程度[7,8]，研究虾青素预保护对其炎症因子分泌和表达以及肠道形态的影响，为虾青素作为食品添加剂的使用以及其在IBD防治中的应用提供试验依据。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物 选取6周龄，体重相近的雄性昆明小鼠40只，购自长春市亿斯实验动物技术有限责任公司[许可证号：SCXK(吉)-2011-0004]。小鼠饲养在12 h明暗交替循环、室温(25±1)℃的无菌动物实验室内，适应环境1周后进行实验。所有组小鼠饲喂标准小鼠日粮，整个饲养期间保证小鼠自由摄食和饮水。

1.1.2主要试剂 虾青素(雅仕达生物技术有限公司)，RNA Lyzol(上海ExCell公司)，cDNA逆转录试剂盒(美国Gene Copoeia公司)，SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ(日本TaKaRa)，引物(上海生工生物)，ELISA试剂盒(美国R&D system公司)，RIPA裂解液(上海碧云天)，NF-κB p65抗体、β-actin抗体(美国CST)，HRP标记的羊抗鼠/兔抗体(天津三箭)。

1.1.3主要仪器 高速冷冻离心机(德国Sigma)，Thermo酶标仪(上海赛默飞世尔)，荧光定量PCR仪、凝胶成像仪(美国Bio-Rad)，切片机(德国Leica)。

1.2方法

1.2.1动物分组及处理 随机将40只小鼠分为4组，每组10只，分别为：对照组、虾青素组、LPS处理组和虾青素+LPS处理组。在LPS注射前连续15 d，对照组和LPS组小鼠每天灌胃0.1 ml/10 g橄榄油；虾青素组和虾青素+LPS组小鼠每天灌胃50 mg/kg虾青素，虾青素溶于橄榄油中。小鼠在第15天灌胃后禁食12 h，之后LPS组和虾青素+LPS组小鼠按1 mg/kg 剂量腹腔注射LPS，LPS溶于无菌生理盐水中。同时，对照组和虾青素组按10 μl/g腹腔注射无菌生理盐水。

1.2.2样品采集 各组小鼠在LPS/生理盐水腹腔注射3 h后，进行血液和肠道组织采集。采集血液：小鼠眼球采血，血液置于1.5 ml离心管中，室温下静置30 min以析出血清，4℃，3 500 r/min离心15 min 分离血清，-20℃保存备用；肠道组织采集：颈椎脱臼处死小鼠，取十二指肠、空肠、回肠，各肠段1～2 cm，4%多聚甲醛溶液固定，待做组织切片。其余肠组织置于生理盐水中清洗，吸干水分后在液氮中速冻，之后置于-80℃冰箱中保存备用。

1.2.3Western blot和ELISA检测各组小鼠组织和血清中炎性水平 根据相关的ELISA检测试剂盒说明书，分别计算各组小鼠血清中TNF-α、IL-6和IL-1β的含量，每组设3个复孔并且每个样本测3个重复值；取出冻存的肠段组织，预冷的PBS洗涤2次，加入含蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液，在冰上进行组织匀浆，12 000 r/min 4℃离心5 min，取上清液，BCA法测蛋白浓度。取20 g总蛋白进行SDS-PAGE电泳，电转印至PVDF膜上，用5%的BSA封闭1 h，一抗为鼠源的NF-κB p65抗体(1∶1 000)， 兔源的β-actin抗体(1∶5 000)， 4℃孵育过夜。TBST洗膜后分别加入相应的二抗:HRP标记的山羊抗鼠IgG(1∶3 000)和HRP标记的山羊抗兔IgG(1∶3 000)， 37℃孵育1 h 。TBST洗膜后，感光，ECL显色，目的条带用Image J进行灰度分析，按以下公式计算蛋白相对表达量：蛋白相对表达量=目的条带灰度值/内参(β-actin)条带灰度值。

1.2.4荧光定量PCR检测各组十二指肠、空肠和回肠TNF-α、IL-6及IL-1β的mRNA相对表达量 根据RNA Lyzol说明书提取各个肠段组织RNA，并测得所有样品浓度和质量，OD260/OD280在1.8～2.0之间，可用于下一步试验。然后按照cDNA逆转录试剂盒的步骤将RNA反转录为cDNA。最后进行荧光定量PCR，采用20 μl的反应体系，SYBR 10 μl、上下游引物各1 μl、cDNA模板2 μl、ddH2O 6 μl，按照95℃预变性30 s，95℃变性5 s，60℃退火30 s，39个循环进行PCR反应，每次试验均设置18 s作为内参。用2-ΔΔCt法计算炎性因子mRNA的相对表达量，引物序列如表1所示。

1.2.5肠组织病理学分析 将各组小鼠十二指肠、空肠和回肠用一系列浓度梯度的乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋、切片，常规脱蜡复水，经苏木精-伊红(HE)染色，中性树脂封片后光镜检查。

1.3统计学方法 试验数据经Microsoft Excel 2010整理，利用SPSS19.0软件进行统计分析，并采用One-way ANOVA分析数据。P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1虾青素对LPS诱导的小鼠血液炎症细胞因子的影响 通过ELISA方法检测小鼠血清中炎症细胞因子的水平，以评价炎症反应严重程度。如图1所示，LPS组血清中炎性因子TNF-α、IL-6和IL-1β的分泌量显著高于对照组(P<0.05)，而虾青素+LPS组显示，TNF-α、IL-6和IL-1β水平均显著低于LPS组(P<0.05)。提示虾青素降低了LPS诱导的血清炎性因子的分泌量，虾青素对细胞炎症因子的分泌有一定的抑制作用。

图1 虾青素对LPS诱导的小鼠血液炎症细胞因子的影响Fig.1 Effect of astaxanthin on inflammatory factors in LPS-induced mice bloodNote: Compared with the control group,#.P<0.05,##.P<0.01；compared with the LPS group,*.P<0.05.

表1 荧光定量PCR引物序列表

Tab.1 Fluorescence quantitative PCR primer sequence

Primer setForward sequence(5′-3′)Reverse sequence(5′-3′)18sCTCAACACGGGAAACCTCACCGCTCCACCAACTAAGAACGTNF-αGTGATCGGTCCCCAAAGGGGTGGTTTGCTACGACGTGIL-6TGGAAATGAGAAAAGAGTTGTGCCCAGTTTGGTAGCATCCATCAIL-1βTTCATCTTTGAAGAAGAGCCCATTCGGAGCCTGTAGTGCAGTT

图2 虾青素对LPS诱导的小鼠肠道炎性因子的影响Fig.2 Effects of astaxanthin on inflammatory factors in LPS-induced mice intestinalNote: A.Effects of astaxanthin on the mRNA relative expression of inflammatory factors in duodenum tissues;B.Effects of astaxanthin on the mRNA relative expression of inflammatory factors in jejunum tissues;C.Effects of astaxanthin on the mRNA relative expression of inflammatory factors in ileum tissues.Compared with the control group,##.P<0.01;compared with the LPS group,*.P<0.05,**.P<0.01.

图3 虾青素对LPS诱导的小鼠肠道NF-κB p65蛋白表达的影响Fig.3 Effect of astaxanthin on protein NF-κB p65 of LPS-induced mice intestinalNote: A.The effect of astaxanthin on protein NF-κB p65 in duodenum tissues;B.The effect of astaxanthin on protein NF-κB p65 in jejunum tissues;C.The effect of astaxanthin on protein NF-κB p65 in ileum tissues.Compared with the control group,##.P<0.01；compared with the LPS group,*.P<0.05,**.P<0.01.

图4 光镜下各组小鼠肠道黏膜组织HE染色(×100)Fig.4 Microscopic examination of HE stained sections of intestinal of groups(×100)Note: Representative HE-stained slices show the typical histological changes in the different groups from:duodenum tissues(A);jejunum tissues(B);ileum tissues(C).

2.2虾青素对LPS诱导的小鼠肠道炎症细胞因子的影响 为了进一步验证虾青素对炎症细胞因子表达的影响，分别提取了十二指肠、空肠和回肠段组织的总RNA，通过荧光定量PCR测量了NF-κB、TNF-α、IL-6和IL-1β的mRNA水平。由图2可知，各肠段的结果均显示，用虾青素预保护可降低炎症因子mRNA相对表达量，且差异有统计学意义(P<0.05)。说明虾青素可抑制NF-κB、TNF-α、IL-6和IL-1β的转录水平。结合血清的结果来看，虾青素可以抑制TNF-α、IL-6和IL-1β等细胞因子的产生和分泌，进而缓解急性肠道损伤。

2.3虾青素对LPS诱导的小鼠肠道NF-κB p65蛋白表达的影响 NF-κB通路是重要的炎症通路之一，激活的NF-κB可与编码炎症因子基因启动子区域的特定序列相结合，进而促进表达对应的炎症因子。如图3所示，LPS组各肠段组织中NF-κB p65蛋白表达量均显著高于对照组(P<0.01)，而虾青素+LPS组NF-κB p65蛋白表达量均显著低于LPS组(P<0.05)，此与各肠段组织中NF-κB mRNA的相对表达量检测结果一致。由此我们推测，虾青素对炎症因子的抑制作用可能是通过抑制NF-κB p65蛋白的表达来实现的。

2.4虾青素对LPS引起的肠道组织病理学观察 显微镜下观测各组小鼠肠道形态和黏膜损伤程度。如图4所示，对照组与虾青素组十二指肠、空肠和回肠结构正常；LPS组十二指肠、空肠和回肠损伤严重，肠道充血、炎性细胞浸润增加，固有层分离并伴有破损；虾青素+LPS组黏膜受损较轻，无绒毛上皮层与固有层分离，极少出现绒毛顶端破损，绒毛状态均匀完整。

3 讨论

炎症是通过消除有害刺激来实现机体自身保护的过程，其存在两个阶段，急性炎症和慢性炎症。急性炎症是炎症的初始阶段，其通过免疫系统的激活介导，这种类型的炎症只持续很短时间，通常对宿主有益。如果炎症持续较长时间，炎症的第二阶段即慢性炎症就会导致宿主患各种慢性疾病，进而引发癌症[9]。

在给小鼠注射LPS后，一系列炎症过程被引发，巨噬细胞和嗜中性粒细胞被激活并释放炎症因子。TNF-α和IL-6是最初的促炎性细胞因子，可进一步刺激IL-1β、IL-8等下游细胞因子的表达，它们都在细胞因子级联反应中起重要作用[10]。据报道，饮食中的虾青素有下调炎症因子水平，抑制活性氧和活性氮，以及保护小鼠心脏线粒体膜的作用[11，12]。此外，一系列体内和体外研究显示，虾青素给药减少了TNF-α，IL-1β或IL-6的释放，虾青素可通过抑制脓毒症大鼠模型中的炎症反应而显著缓解多器官损伤[13-16]。本研究验证了前人的结果并提出其在小肠组织中对以上炎症因子mRNA表达量的影响。我们当前的研究表明，虾青素显著降低LPS诱导的急性肠道炎症反应中血清TNF-α、IL-6或IL-1β的分泌，并进一步验证了其可对组织中炎症因子mRNA水平的下调产生积极影响，而后通过H&E染色从病理形态学角度展示了虾青素对急性肠道炎症反应在肠道形态学上的改善和保护作用，进而说明了其在小鼠急性肠道炎症反应中的抗炎作用。

另外，核转录因子NF-κB对炎症反应有很大影响，当刺激激活NF-κB时，它被磷酸化并且其转录增强以发挥其功能。已有研究证实，TNF-α、IL-6或IL-1β基因的启动子均存在NF-κB的结合位点，其表达受NF-κB活性的调控[17]。NF-κB在炎症过程中的激活增加了促炎细胞因子，如TNF-α、IL-1β、IL-6和其他促炎基因(包括趋化因子，黏附分子和一氧化氮)的表达水平[14]。虾青素具有比角黄素、β-胡萝卜素或玉米黄质高十倍的抗氧化活性[18]，它可以减缓氧化应激和硝化应激，保护细胞和组织免受自由基损伤[19]。在对急性肺损伤的研究中发现虾青素能够下调NF-κB p65的表达，缓解氧化应激并抑制炎症[15]。另外Yasui等[20]在小鼠结肠炎的研究中提出，虾青素通过抑制NF-κB活化的抗炎作用可能基于其抗氧化活性。尽管一系列研究表明虾青素在抗炎、抗氧化等方面具有积极作用，但它在IBD中确切作用机制仍需进一步探索，其可能与修复改善肠道功能完整性和改善肠道菌群有着千丝万缕的联系。此外虾青素是安全的，并已被用作保健品或食品添加剂，这些都指示着虾青素是一种潜在的保护IBD的新方法。但是我们的研究仅基于动物试验，需要前瞻性临床研究来评估虾青素是否适用于急性肠道损伤的临床治疗。

总之，本研究表明虾青素可以通过抑制NF-κB p65的表达并且降低血液和组织中炎性因子的分泌和表达来减轻LPS诱导的急性肠道损伤，此外其还可维持肠道完整性。潜在的机制可能受益于其强大的抗氧化和抗炎活性。虾青素可能是炎症性肠病的潜在疗法。