徐鸿婕 孙勤国

(武汉市第三医院中医科，武汉430000)

多囊卵巢综合征(Polycystic ovary syndrome，PCOS)是一种在育龄妇女中常见的内分泌生殖疾病，患者表现为胰岛素抵抗、雄激素过多、持续无排卵等，近年的发病率呈现上升趋势，确切的病因尚未明确[1]。有研究指出，卵泡内颗粒细胞异常地增殖及凋亡可能是PCOS患者多个卵泡同时发育的病理基础[2]。因此，研究影响卵巢颗粒细胞增殖凋亡的机制具有重要意义。透明质酸合成酶2(Hyaluronan synthetase 2，HAS2)是透明质酸(Hyaluronan,HA)的一种异构体，其过表达可引起透明质酸的过度分泌，有研究资料显示，在小鼠卵母细胞成熟过程中HAS2基因会伴随卵丘扩张而表达升高，抑制HAS2可增强卵巢颗粒细胞的凋亡[3,4]。这提示HAS2可能影响PCOS的发生发展。在本研究中首先检测了HAS2在PCOS中的表达，并将干扰HAS2的siRNA转染到PCOS大鼠卵巢颗粒细胞中，观察细胞的增殖及凋亡情况，并研究潜在的分子机制，以期为PCOS的治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1材料 DMEM/F12培养基、胰蛋白酶、胎牛血清均购自美国Gibco；BCA试剂盒、CCK8试剂盒均购自碧云天；LipofectamineTM2000转染试剂购自美国Invitrogen；HAS2、TGF-β1、VEGF、p-NF-κB、p-IκB、cyclin D1和survivin抗体均购自美国CST；Annexin V-FITC/PI细胞凋亡试剂盒购自南京凯基；注射用脱氢表雄酮(Dehydroepian drosterone，DHEA)购自湖北远成药业公司；酶标仪购自美国Bio-Rad；流式细胞仪购自美国BD。

1.2方法

1.2.1PCOS大鼠模型卵巢组织采集 SPF级雌性SD大鼠购自武汉大学动物实验中心，21日龄，共30只。将大鼠适应性饲喂2 d，随机分为对照组和实验组，每组15只。PCOS模型建立：大鼠持续肌肉注射DHEA(6 mg/100 g体重)及注射用油0.2 ml，共注射21 d，对照组在此期间仅注射0.2 ml的注射用油。注射DHEA第21天，将大鼠禁食12 h后称重，摘取卵巢组织，备用。

1.2.2Western blot检测两组卵巢组织中HAS2的表达 卵巢组织中加入适量的裂解液提取组织总蛋白，BCA试剂盒检测总蛋白浓度，取50 μg总蛋白上样，经12%的SDS-PAGE、电转PVDF膜、5%脱脂奶粉封闭膜，加入1∶500稀释的HAS2抗体及1∶1 000 稀释的内参GAPDH抗体，4℃摇床孵育过夜，洗膜，加入HRP标记的二抗(1∶5 000稀释)，37℃摇床孵育1 h，洗膜，ECL发光剂显色，洗片后进行显影和定影。以GAPDH为内参，以HAS2与GAPDH的灰度比值作为HAS2的蛋白相对表达量。

1.2.3卵巢颗粒细胞的获取 在雌性大鼠于DHEA干预21 d后，DHEA诱导大鼠及空白对照组大鼠分别断颈处死，获取卵巢器官。在解剖镜下用注射器刺破卵巢上的卵泡，使颗粒细胞释放出来。用移液器吸取颗粒细胞，使用含15%胎牛血清的DMEM培养液清洗3次后，于37℃，5%体积分数的CO2培养箱中预培养 24 h。

1.2.4分组及siRNA转染 将卵巢颗粒细胞分为空白组(Control组)、PCOS大鼠模型卵巢颗粒细胞分成阴性对照组(NC组)和si-HAS2组。NC组和si-HAS2组分别转染合成的无干扰作用的siRNA及靶向抑制HAS2的特异性siRNA，转染前24 h以每孔2×105个细胞的数量将生长至对数期的卵巢颗粒细胞接种于6孔板，细胞生长密度达90%以上时，参照LipofectamineTM2000转染说明进行转染。收集转染48 h的细胞，Western blot检测各组细胞中HAS2的蛋白表达。

1.2.5CCK8检测细胞活力 以每孔2 000个细胞接种生长至对数期的卵巢颗粒细胞于96孔板，细胞生长融合达50%时，按照上述分组转染，每组设置5个重复孔，转染48 h后每孔细胞中加入10 μl CCK8，37℃孵育4 h，450 nm波长，酶标仪检测光密度(OD)值。实验重复3次。

1.2.6流式细胞仪检测凋亡 采用Annexin V-FITC/PI双染法，以每孔1×105个细胞的数量接种卵巢颗粒细胞于6孔板的培养皿，细胞生长融合达80%时，无血清培养细胞24 h，按照上述分组转染，转染后48 h，胰酶消化细胞，制备成细胞悬液，离心后重悬细胞，加入Annexin V-FITC和PI各5 μl，混匀，避光反应1 h内，流式细胞仪进行凋亡检测。实验重复3次。

1.2.7TGF-β1、VEGF、p-NF-κB、p-IκB、cyclin D1和survivin蛋白表达检测 参照1.2.2方法。

2 结果

2.1HAS2在PCOS大鼠卵巢组织的表达 建立PCOS大鼠模型，取出卵巢组织，Western blot检测卵巢组织中HAS2蛋白表达，结果如图1所示，对照组及PCOS组卵巢组织中HAS2的蛋白表达分别为0.069±0.008、0.556±0.043，HAS2在PCOS中的表达显著高于对照组(P<0.05)。

2.2si-HAS2转染大鼠卵巢颗粒细胞的效果 各组转染si-HAS2的细胞中HAS2的蛋白表达结果如图2所示，对照组、NC组及si-HAS2组HAS2的蛋白表达分别为0.458±0.046、0.471±0.049和0.103±0.011，si-HAS2组HAS2的表达显著低于对照组(P<0.05)，而NC组HAS2的表达与对照组差异无统计学意义(P>0.05)。

2.3si-HAS2转染对大鼠卵巢颗粒细胞活力及凋亡的影响 si-HAS2转染大鼠卵巢颗粒细胞48 h后，细胞活力及凋亡率的检测结果显示，与NC组比较，si-HAS2组细胞活力显著降低(P<0.05)，凋亡率升高(P<0.05)，见表1、图3。

2.4si-HAS2转染对大鼠卵巢颗粒细胞免疫因子表达的影响 Western blot检测各组细胞中免疫抑制因子TGF-β1和VEGF的蛋白表达，结果如图4和表2所示，与NC组比较，si-HAS2组TGF-β1和VEGF的蛋白表达均显著降低(P<0.05)。

2.5si-HAS2转染对大鼠卵巢颗粒细胞NF-κB信号通路的影响 各组细胞中NF-κB信号通路p-NF-κB、p-IκBα及下游cyclin D1和survivin的蛋白表达结果如图5和表3所示，与NC组比较，si-HAS2组p-NF-κB、p-IκBα、cyclin D1和survivin的蛋白表达均显著降低(P<0.05)。

图1 HAS2在PCOS和对照大鼠卵巢组织的表达Fig.1 Expression of HAS2 in ovarian tissue of PCOS and control rats

图2 si-HAS2转染大鼠卵巢颗粒细胞后HAS2的蛋白表达Fig.2 Protein expression of HAS2 after transfected si-HAS2 in rat ovarian granulosa cells

表1 si-HAS2转染对大鼠卵巢颗粒细胞活力及凋亡的影响

Tab.1 Effect of si-HAS2 transfection on vitality and apoptosis of rat ovarian granulosa cells

Groups ODApoptosis rate(%)Control group0.415±0.0342.45±0.11NC group0.402±0.0312.61±0.18si-HAS2 group0.277±0.0261)18.26±0.671)

Note： Vs NC group，1)P<0.05.

图3 si-HAS2转染对大鼠卵巢颗粒细胞凋亡的影响Fig.3 Effect of si-HAS2 transfection on apoptosis of rat ovarian granulosa cells

图4 si-HAS2转染对大鼠卵巢颗粒细胞免疫因子TGF-β1和VEGF表达的影响Fig.4 Effect of si-HAS2 transfection on expression of TGF-β1 and VEGF in rat ovarian granulosa cells

表2 si-HAS2转染对大鼠卵巢颗粒细胞免疫因子TGF-β1和VEGF表达的影响

Tab.2 Effect of si-HAS2 transfection on expression of TGF-β1 and VEGF in rat ovarian granulosa cells

Groups TGF-β1 VEGFControl group0.431±0.0380.311±0.028NC group0.456±0.0420.329±0.030si-HAS2 group0.115±0.0131)0.102±0.0091)

Note： Vs NC group,1)P<0.05.

图5 si-HAS2转染对大鼠卵巢颗粒细胞NF-κB信号通路的影响Fig.5 Effect of si-HAS2 transfection on NF-κB signaling pathway in rat ovarian granulosa cells

表3 si-HAS2转染对大鼠卵巢颗粒细胞NF-κB信号通路的影响

Tab.3 Effect of si-HAS2 transfection on NF-κB signaling pathway in rat ovarian granulosa cells

Groupsp-NF-κBp-IκBαcyclinD1survivinControl group0.162±0.0140.141±0.0120.589±0.0580.196±0.023NC group0.154±0.0120.134±0.0110.552±0.0450.211±0.025si-HAS2 group0.077±0.0081)0.059±0.0071)0.187±0.0211)0.145±0.0161)

Note：Vs NC group,1)P<0.05.

3 讨论

PCOS的病因较为复杂，目前也没有公认的建立PCOS动物模型的标准，临床上多用孕激素联合人绒毛膜促性腺激素注射、DHEA肌肉注射等方法[5,6]。在本研究中使用DHEA肌肉注射方法建立PCOS大鼠模型。HA属于细胞外基质的组成结构，可通过与细胞表面受体互作影响细胞的生长、增殖、黏附等细胞行为[7]。HAS2为HA的一种异构体，过表达HAS2可引起HA的过度分泌，HAS2的表达失控可引起多种肿瘤的发生发展[8,9]。此外，有研究发现，HAS2表达会随着卵母细胞成熟而升高[10]。在PCOS中HAS2的研究较少，有研究发现，靶向抑制HAS2可增强卵巢颗粒细胞的凋亡[4]。在本研究中，通过Western blot检测PCOS大鼠模型卵巢组织中HAS2表达，发现HAS2在卵巢组织中呈现出高表达。这提示HAS2可能影响PCOS的发生发展。由于RNA干扰(RNAi)是一种新的特异性沉默基因表达的技术，具有高效特异性，且在基因功能方面应用十分广泛[11,12]。因此，本研究中通过此技术沉默PCOS大鼠卵巢颗粒细胞HAS2，(发现HAS2表达受到抑制后卵巢颗粒细胞的增殖明显，VEGF作为卵巢内的调节因子，可通过自分泌和旁分泌途径调控人体卵巢血管生成)，多篇文献报道VEGF在PCOS患者卵泡中表达明显升高，且主要在卵泡颗粒细胞中表达，而在健康妇女中表达无明显变化[13,14]。也有研究表明，抑制VEGF可阻碍黄体形成及发挥功能，这提示在靶向治疗PCOS中抑制VEGF可能是一个有效的途径[15]。TGF-β1在多种组织器官中广泛分布，在细胞的免疫应答、增生、分化等过程中有双向调节作用，作为VEGF的上游因子，可促进血管的生长[16]。有研究发现，TGF-β1参与调控PCOS的卵泡发育及闭锁[17]。在本研究中抑制PCOS大鼠卵巢颗粒细胞HAS2表达后VEGF和TGF-β1的表达均显著降低。这提示HAS2可能通过抑制VEGF和TGF-β1表达影响PCOS的发生发展。NF-κB是一个核转录因子，调节炎症、免疫等过程，有研究显示，miR-146a可通过抑制TRAF6、IRAK1的转录而使NF-κB的活性受到抑制，进而诱导卵巢颗粒细胞发生凋亡[18]。在本研究中发现，抑制HAS2在卵巢颗粒细胞的表达后NF-κB信号通路中p-NF-κB、p-IκBα及下游cyclin D1和survivin的表达均明显降低。cyclin D1是一个与细胞增殖相关的蛋白，在卵巢颗粒细胞中可通过下调cyclin D1表达抑制细胞增殖[19]。survivin是一个凋亡抑制蛋白，PCOS中survivin的表达升高[20]。因此，本研究的结果提示HAS2可通过抑制NF-κB信号降低卵巢颗粒细胞增殖和诱导凋亡。

综上所述，PCOS中HAS2高表达，抑制大鼠卵巢颗粒细胞中HAS2表达可降低细胞活力，诱导细胞凋亡，机制可能与下调免疫抑制因子TGF-β1和VEGF及NF-κB信号通路表达有关。本研究可能为HAS2在PCOS中的作用研究奠定了一定的基础。