刘湄漪 陈乃耀 周 葳 崔亚欢 刘 竞 冯会超

(华北理工大学附属医院血液内科，唐山063000)

来源于原始的髓系祖细胞的小胶质细胞，是中枢神经系统(CNS)的固有免疫细胞，在中枢神经系统的免疫监测和稳态维持中起着关键作用[1]。小胶质细胞在脑损伤、全身感染和慢性疾病的反应中发生局部激活[2]，分泌多种炎症介质，包括TNF-α、IL-1β、IL-6和NO[3]，参与脑内炎症反应的启动。新近许多研究已经将神经元损伤归因于小胶质细胞的炎症反应，而不是直接的神经毒性损伤[4]。在炎症初期，小胶质细胞表现为促炎型即经典活化型 (M1)，分泌多种炎症因子。急性炎症后期，M1型小胶质细胞向抗炎型即旁路活化型(M2)转化，分泌抗炎细胞因子有助于神经保护[5]。故此，在增强抗炎、促生长表型的同时，以抑制促炎表型为目标的免疫治疗，将会对神经保护作用有很大的益处。间充质干细胞(Mesmalmal stem cells，MSCs)是一类多能细胞，具有自我更新和潜在的多系特性，是中枢神经系统损伤修复的理想细胞来源。有研究表明间充质干细胞能够促进小胶质细胞向M2型活化，上调抗炎介质表达，并增强其吞噬作用[6]，但其机制尚不清楚。研究表明，MSCs分泌多种生物活性分子，如营养因子和抗炎分子，以调节宿主的微环境[7]，MSCs的旁分泌作用可能是其治疗作用的主要途径[8]。

脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)是小胶质细胞的刺激因子，LPS激活的小胶质细胞分泌TNF-α、IL-1β和IL-6等促炎细胞因子，这些细胞因子在炎症相关疾病中起主要作用[9]。因此，本实验拟通过LPS刺激诱导小胶质细胞活化，脐带间充质干细胞的条件培养基(hUC-MSCs-CM)干预，观察小胶质细胞活化的表型变化，了解hUC-MSCs-CM是否调节M1/M2极化的变化，并且探讨其潜在的机制。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1细胞来源 脐带取自华北理工大学附属医院产科，经过伦理委员会批准并得到家属同意。MSCs由脐带组织中分离提取，连续传4代以上。BV2 细胞购自广州赛库生物技术有限公司。

1.1.2主要试剂 LPS购自Sigma；胎牛血清购自PAN；胰蛋白酶、Ⅱ型胶原酶购自Gibco；双抗、DMEM(高糖)、IMEM均购自CORNING；SDS-PAGE凝胶制备试剂盒、超敏ExPlus ECL化学发光检测试剂盒、TNF-α、IL-6 ELISA试剂盒购自ZOMANBIO；PhosSTOP购自Roche；BCA法蛋白定量试剂盒购自MultiSciences；BSA购自BOVOGEN；LDS Sample Buffer(5×)购自Thermo Fisher；ACTB抗体购自ABclonal；CD86抗体购自arigo；Arg1抗体购自GeneTex；PI3K抗体购自BIOSS；HPR标记的兔、鼠二抗购自KPL公司。

1.2方法

1.2.1脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)原代培养 将脐带组织进行酶解和机械分离，再通过230和130 微孔的尼龙网进行过滤，制备了初级混合脐带组织培养物。单细胞悬液以1×106～10×106个细胞/ml在混合有10%FBS 、1%青链霉素的IMEM中培养，4～18 h后，冲洗培养物以去除非贴壁细胞。37℃、5%CO2湿度良好的环境中恒温培养，经过换液、传代，得到纯脐带间充质干细胞。

1.2.2BV2细胞培养 将BV2细胞培养在T25培养瓶中，加入含有10%FBS、1%青链霉素的DMEM高糖培养基，在37℃、5%CO2、湿度良好的条件下生长，密度达到80%以上，1∶4 传代。

1.2.3hUC-MSCs-CM制备 取生长良好的3～4代hUC-MSCs，以1×106个/ml浓度接种于细胞板，24 h细胞贴壁，更换无血清IMEM培养基，培养48 h后，将上清转移至15 ml离心管，4℃条件下5 000 g离心10 min，以清除细胞碎片，加入适量的血清及青链霉素配成完全条件培养基备用。

1.2.4分组实验 实验共分4组：空白对照组(control组)，单纯LPS刺激组(LPS组)，单纯hUC-MSCs-CM刺激组(MSCs-CM组)，LPS、hUC-MSCs-CM共刺激组(LPS+MSCs-CM组)。选取对数期生长良好的BV2细胞铺板进行实验，以5×105个细胞接种于6孔板中，贴壁过夜后，分别给予1 μg/ml LPS和(或)hUC-MSCs-CM刺激24 h进行实验。

1.2.5流式细胞学鉴定 流式细胞术检测间充质干细胞的免疫表型。用0.25%的胰蛋白酶消化细胞，用PBS(pH=7.4)洗涤3次，用CD19、CD34、CD45、CD73、CD90、CD105、CD11b和HLA-DR(美国BD)在常温、黑暗中培养30 min，再用PBS洗涤、悬浮。利用CXP软件对20 000细胞在FC 500(FACSCalibur，BD，USA)上的特异性荧光进行分析。

1.2.6酶联免疫吸附试验(ELISA) 收集各组24 h培养的细胞上清进行实验，严格按照TNF-α、IL-6试剂盒操作步骤进行，用酶标仪进行OD值测定，波长为490 nm，绘制标准曲线，并计算TNF-α 和IL-6浓度。

1.2.7Western blot 6孔板中各组细胞培养24 h后，应用invent提取试剂盒分别提取各组细胞的总蛋白和膜蛋白，BCA试剂盒进行浓度测定，等量上样，用10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质，然后转移到聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜)上。5%BSA封闭2 h，然后与一抗体在4℃下孵育过夜(抗β-actin 1∶5 000稀释；抗Arg1 1∶500稀释；抗CD86 1∶1 000稀释；抗p-PI3K、PI3K 1∶1 000稀释)，TBST洗膜3次，10 min/次，二抗室温孵育1 h (抗兔、抗鼠1∶2 000稀释)，TBST洗膜3次，10 min/次，利用增强化学发光技术显影，用Image J软件(NIH)进行灰度值分析。

2 结果

2.1hUC-MSCs-CM的形态特征 倒置显微镜下hUC-MSCs呈梭形、短杆状的贴壁细胞。单个的细胞为成纤维状，折光性强，胞质丰富，极性分布，细胞汇合时呈平行排列、旋祸状生长见图1。

2.2hUC-MSCs-CM表面标志物流式细胞学检测结果 通过双酶序贯法从脐带组织提取的hUC-MSC均一地表达基质细胞相关的表面标记CD73、CD90、CD105，不表达CD19，不表达造血干细胞表面标记 CD11b、CD34，不表达人类白细胞共同抗原CD45以及MHCⅡ类分子HLA-DR，符合间充质干细胞的表型特征(图2)。

2.3hUC-MSCs-CM和LPS对BV2分泌TNF-α和IL-6的影响 与空白对照组相比，LPS组分泌TNF-α和IL-6明显增高，LPS+MSCs组与单纯LPS组相比TNF-α和IL-6水平明显降低，且差异均有统计学意义(P<0.05)，见图3。

图1 显微镜下观察第三代hUC-MSCs的形态特征(×100)Fig.1 Microscope morphological characters of third generation hUC-MSCs(×100)

图2 培养至第二代的hUC-MSCs流式细胞仪检测表面抗原Fig.2 Cultivated to second generation of hUC-MSCs in FCM instrument testing surface antigen

图3 BV2细胞分泌TNF-α和IL-6的变化Fig.3 Changes of TNF-α and IL-6 secreted by BV2 cellsNote: A.Changes of secretory TNF-α level in BV2 cells.n=3.*.P<0.05 vs LPS group;B.Changes of secretory IL-6 level in BV2 cells.n=3.#.P<0.05 vs LPS group.

2.4hUC-MSCs-CM逆转LPS诱导的M1和M2表型改变 CD86为活化小胶质细胞M1型特异性标志物，与空白对照组相比，LPS刺激24 h后，CD86表达明显上调(P<0.05)，但LPS+MSCs联合刺激组与单纯LPS组相比，CD86表达降低，差异具有统计学意义(P<0.05)，Arg1为M2型活化小胶质细胞的特异性标志物，Western结果显示MSCs组、LPS+MSCs组与空白对照组相比，Arg1蛋白表达量明显上调，差异有统计学意义(P<0.05)，见图4、5。

2.5hUC-MSCs-CM对PI3K信号通路的影响 Western结果显示，与空白对照组相比，MSCs组、LPS+MSCs组的PI3K磷酸化水平明显上调，差异有统计学意义(P<0.05)，见图6。

图4 CD86蛋白表达水平Fig.4 CD86 protein expression levelNote: n=3.*.P<0.05 vs LPS group.

图5 Arg1蛋白表达水平Fig.5 Arg1 protein expression levelNote: n=3.*.P<0.05 vs other groups.

图6 PI3K蛋白表达水平Fig.6 PI3K protein expression level Note: n=3.*.P<0.05 vs other groups.

3 讨论

在免疫活动中，小胶质细胞是CNS中主要免疫细胞。小胶质细胞的激活状态包括两种形式：经典激活(M1)和旁路激活(M2)亚型。M1型小胶质细胞是一种促炎细胞状态，与炎症细胞因子(包括IL-1、TNF-α和iNOS)过度表达有关，而M2极化小胶质细胞状态释放有益的介质，包括IL-4、IL-10和TGF-β，从而使CNS达到稳态、再生和神经保护作用[10，11]。这些双重和相反的激活表型决定了脑损伤后炎症反应的调节。在颅脑损伤后初始阶段，M1促炎作用占主导地位，大量的炎症因子被释放出来。炎症后期，小胶质细胞表型从M1极化状态过渡到M2型，抑制促炎症介质以及加强组织修复[12]。然而，慢性炎症反应通常是由于对促炎过程无效地抑制而发生的。因此，小胶质细胞从M1向M2的转化可能是治疗颅脑损伤的靶点。研究表明，间充质干细胞(MSCs)可通过改变小胶质细胞极化而对神经元损伤有保护作用，且其作用途径与MSCs的旁分泌有关[8]。故我们利用hUC-MSCs-CM研究hUC-MSCs是否以旁分泌的方式调节宿主小胶质细胞，并且探讨其作用机制。

ELISA结果提示，与LPS组相比，LPS+MSCs联合刺激组的TNF-α、IL-6等炎性因子分泌明显减少。Western结果显示，LPS+MSCs组CD86的蛋白表达量明显低于LPS组，且Arg1蛋白表达量明显高于LPS组。因此，实验结果表明hUC-MSCs可以通过外分泌的方式，逆转M1标记的增加趋势，且刺激了M2标记的积累，促进了小胶质细胞从M1向M2的转化，抑制小胶质细胞TNF-α、IL-6等炎性因子的分泌。磷酸肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)通路被认为是调节细胞生长、增殖、糖代谢、转录、蛋白质合成和细胞存活的途径[13]。此外，PI3K/AKT还调节细胞活化、炎症反应和凋亡[14]。PI3K通路在小胶质细胞活化中起主要的抗炎作用。在诱导抗炎和免疫调节细胞因子如IL-10、IL-1Rα和IFN-β等方面发挥非常重要的作用。小胶质细胞中PI3K/AKT通路的激活，可在神经炎症状态下起到抗炎作用和促进神经修复[15]。研究表明，IRF 3基因治疗可能通过激活PI3K/AKT信号通路，促进小胶质细胞表型从促炎(M1型)向抗炎(M2型)的转变[16]。因此，我们探讨hUC-MSCs促进小胶质细胞M1型向M2型转化是否与PI3K信号通路的激活有关。Western结果显示MSCs组、LPS+MSCs组的PI3K磷酸化水平较空白对照组明显上调，这与M2型小胶质细胞特异性标志物Arg1蛋白表达趋势一致，因此，我们推测hUC-MSCs通过上调PI3K信号通路在小胶质细胞M1/M2极化中起重要作用。

综上所述，hUC-MSCs可通过非接触的方式明显抑制LPS诱导的小胶质细胞炎症因子的分泌，如TNF-α、IL-6等。并且验证了hUC-MSCs可改变LPS诱导小胶质细胞炎症激活表型，由促炎症型(M1型)转变为抗炎免疫调节型(M2-型)，这一结果可能通过激活PI3K/AKT通路实现的。