叶质强，冯露，王心洁，鄂松

（湖北省宏源药业科技股份有限公司，湖北黄冈 438600）

转氨酶是可催化氨基酸与酮酸之间氨基转移的一类酶，普遍存在于动植物组织和微生物中作为生物催化剂可用于制备手性胺类化合物，其催化效率高、选择性强，相比较化学合成方法具有反应条件温和、转化率高、立体结构专一、成本低等优势。酶催化方法制备手性化合物是目前不对称合成领域重要的研究方向[4]。

西格列汀是由美国Merck公司开发生产用于治疗Ⅱ型糖尿病的DPP-Ⅳ抑制剂类药物。由于传统化学合成方法条件苛刻，产率较低，导致成本较高，Merck公司通过和Codexis公司合作开发了一种新型生物催化剂——转氨酶，使用该酶催化200 g/L浓度底物24h转化率达92%，ee值大于99.5%。该方法路线（图1）将转化率提高了13%，同时减少了19%的废物[6]，因此法获得了2010年美国总统绿色化学挑战奖，也为药物的手性合成提供了新方向。

本实验中使用的是一种来自网络节杆菌（Arthrobacter sp. KNK168）菌野生型（R）-选择性转氨酶克隆基因，通过构建表达质粒PE-ATS在大肠杆菌BL21（ED3）中重组突变得到的菌株，可用于表达转氨酶催化底物转化西格列汀。为提高酶的表达活性，采用单因素和正交实验来优化菌株培养基组成，并对酶的诱导条件进行优化，获得可高效表达转氨酶的培养基和诱导条件，为后期放大试验提供了参考和依据。

图1 酶催化合成西格列汀路线

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 菌种

E.coli Bl21

1.1.2 试剂

胰蛋白胨（以下统称蛋白胨）和酵母浸粉（以下统称酵母粉），安琪酵母公司；蔗糖，阿拉丁试剂；诱导剂（IPTG），赛默飞；氨苄青霉素，Borship；底物（CAS：764667-65-4）、西格列汀标准样，Sigma；其它原料均为国药分析纯试剂。

1.1.3 培养基

LB培养基：蛋白胨10.0 g/L、酵母粉5.0 g/L、氯化钠10.0 g/L，氨苄1‰。

发酵培养基：葡萄糖5.0 g/L、酵母粉10.0 g/L、氯化钠2.0 g/L、磷酸氢二钾3.0 g/L、磷酸二氢钠1.0 g/L、氨苄1‰。

1.1.4 仪器设备

SX-700蒸汽灭菌锅（日本TOMY）；TGL-20MS离心机（湘仪）；Scientz-ⅡD超声波细胞粉碎机（宁波新芝）；C-MAG HS 10 digital搅拌器（IKA）；HZQ-311C摇床（上海一恒）；L5/UV759紫外分光光度计（上海精密）；垂直型槽电泳仪（北京君意）；ME104分析天平（梅特勒）；高效液相色谱仪（安捷伦1260）。

1.2 实验方法

1.2.1 培养方法

工程菌保存：将菌种划线于LB（Amp）固体培养基上，37 ℃恒温箱培养24 h，挑取单菌落接种于LB（Amp）液体培养基中，培养至对数生长期按1 ：1比例加入30%甘油水溶液，分装100 μL/管，放置-80 ℃保存。

菌种活化：从冰箱中取1支菌种，快速融化，按1%量接种于含LB培养基的试管中，加入1‰的氨苄青霉素，置于37 ℃摇床中，210 r/min培养12 h。

1.2.2 发酵条件

培养基装液量为摇瓶体积的1/5，加入1‰氨苄青霉素，接种量2%，温度37 ℃，摇床180 r/min，培养4 h，加入0.5 mmol/L IPTG诱导培养5 h。

1.2.3 菌体浓度（OD600）测定

发酵液适当稀释后，在分光光度计600 nm波长处测定吸收值（要求每次读数≤0.8），每个样测量3次，取平均值作为结果，然后乘以稀释倍数即为发酵液OD600值。

1.2.4 表达量检测

SDS-PAGE检测酶的表达情况：配制12%分离胶+5%浓缩胶，取1 mL发酵液离心收集菌体，加入上样缓冲液100 μL，开水煮沸，置于冰上10 min，取上清10 μL上样，80 V电泳过浓缩胶，换110 V至结束。考马斯亮蓝染色2 h，甲醇-醋酸混合液脱色过夜。

1.2.5 酶活性测定

将发酵液离心得到菌丝体，加入缓冲液充分混匀并用超声波破碎，催化一定浓度的底物转化为西格列汀，使用高效液相色谱（HPLC）检测生成物峰面积（图2），与标准样品浓度峰面积对比并计算出底物单位时间转化量，得出酶活性。以西格列汀标准样品溶液浓度为横坐标（X），色谱峰面积（测3次取平均值）为纵坐标（Y）作标准曲线（图3）。酶活定义：按照酶活性试验与检测方法，1 min 催化1μmol底物转化为西格列汀所需的酶量为一个活力单位(U)。

酶活性试验与检测方法 取1 mL发酵液离心，去掉上清，加入等体积PBS，超声破碎30 s再分别加入45% DMSO、10 g/L底物、2.0 mol/L异丙胺盐、1 mmol/L磷酸吡哆醛（PLP），异丙胺调节pH值为8.5，反应总体积为3 mL，在45 ℃下反应30 min后立即取出，快速加入等量乙腈充分混匀，离心，取上清液微滤稀释后通过HPLC检测。条件为：安捷伦1260机型，SB-C18/ 4.6×150 mm/5μm色谱柱，流动相为0.1%磷酸-水溶液/乙腈，检测波长267 nm，进样量10 μL，流速 1 mL/min。

图2 西格列汀与底物HPLC图

图3 西格列汀浓度与峰面积标准曲线

1.2.6 培养基优化

以发酵液OD600为指标，考察碳源、氮源和无机盐对其影响。单因素实验分别选用葡萄糖、甘油、蔗糖作为碳源，浓度为3、6、9、12、15 g/L和18 g/L；蛋白胨、酵母粉、玉米作为氮源，浓度为4、8、12、16、20 g/L和24 g/L；正交实验选用硫酸铵、氯化钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钠4种无机盐确定最优配比，条件见表1。

表1 无机盐浓度正交实验因素与水平 （单位g/L）

1.2.7 发酵诱导条件优化

以酶活性和表达量作为考察指标，通过单因素实验分别选取不同诱导温度分别为28、30、32、34、36、38、40 ℃，诱导时间分别为 2、4、6、8、10、12h，诱导剂浓度分别为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mmol/L。以上培养条件均同实验方法（2.2.2），每次实验得出最优结果将置换下一次实验其他同因素。

2 结果与分析

2.1 不同碳源及其浓度选择

碳源是组成细胞成分的碳架，为细胞生长代谢提供能源，常见的碳源有甘油、葡萄糖，蔗糖、可溶性淀粉等[8]。由图4可知：甘油从3 g/L增加到6 g/L时菌生长速率最快，到9 g/L时OD达到最高，继续增加浓度呈下降趋势；随着葡萄糖浓度增加OD600快速增长，当浓度大于9 g/L后增长缓慢；蔗糖浓度对菌密度影响趋势与葡萄糖相似，但低于葡萄糖。综合分析，选用甘油作为培养基碳源，浓度为9 g/L。

图4 不同碳源及其浓度对菌密度影响

2.2 不同氮源及其浓度选择

氮源作为细胞蛋白质和代谢产物合成的重要营养物质，一般可分为有机氮和无机氮两大类，常见有机氮源有蛋白胨、酵母粉、玉米浆等，无机氮源主要有硝酸盐和铵盐类。实验室常用有机氮源，可为菌提供丰富的蛋白质、多肽及不同的微量元素和生长因子，有利于蛋白质的合成与表达。由图5可知，酵母粉作氮源，当其浓度在16 g/L时增长速度和OD600最高；使用蛋白胨浓度增长速度变缓；玉米粉作氮源菌密度相对偏低。因此选用酵母粉作为氮源，浓度为16 g/L。

2.3 不同浓度无机盐配比对菌生长影响。

无机盐是微生物生长和代谢不可缺少的营养物质，是构成细胞的组织成分，具有维持酶的活性、调节渗透压等作用[7]。正交实验结果显示，硫酸铵对菌体生长影响最为显著，氯化钠影响作用最小。影响主次硫酸铵＞磷酸氢二钠＞磷酸二氢钾＞氯化钠；最优配比组合A2D2C3B2，依次浓度为硫酸铵4.0 g/L、磷酸氢二钠2.0 g/L、磷酸二氢钾3.0 g/L、氯化钠6.0 g/L，见表2、表3。

图5 不同氮源及其浓度对菌密度影响

表2 无机盐配比优化结果与分析

表3 正交实验结果方差分析

2.4 不同温度下诱导结果

由图6、图7可知，酶活性和表达量随着诱导温度的上升而增加，在36 ℃活性达到最大；继续升温，出现较多杂蛋白，酶活性也快速降低，温度过高和过低都不利于酶的表达。因此，在36 ℃条件下诱导最适宜。

图6 不同诱导温度对酶活性影响

图7 不同诱导温度对酶表达量影响 （28-40℃）

2.5 不同诱导时间结果

由图8、图9得知，酶活性在诱导4 h后最大，随着时间的增加，包涵体浓度增加，酶活性有所下降。因此，选择诱导时长为4 h。

图8 不同诱导时间对酶活性影响

图9 不同诱导时间对酶表达量影响

2.6 不同诱导剂浓度下诱导结果

由图10、图11可知，在诱导剂浓度为0.8 mmol/L时，酶表达量最高，活性最高。浓度从0增加到0.6 mmol/L，酶活性也快速增加，浓度从0.6增加至0.8时，酶活性增量不明显，继续增加诱导剂浓度对酶活性没有明显影响。因此从经济角度考虑，选择0.6 mmol/L浓度适宜。

图10 不同浓度诱导剂对酶活性影响

图11 不同浓度诱导剂对酶表达量影响

3 结论

从实验可以看出，甘油作碳源更适合菌的生长，可能相对于葡萄糖不容易产酸、乙醇等有害代谢物；使用蛋白胨作为氮源菌生长更快一些，最后随着浓度的增加两者OD值基本达到一致，发酵过程中多采用二者搭配使用来促进菌体更高密度的增长；添加无机盐对菌的生长代谢有促进作用，其中硫酸铵对菌密度影响最大，可能是氮元素的增加促进了菌的生长；诱导条件作为影响酶表达和活性关键因素，通过SDSPAGE分析酶表达量和HPLC测定酶催化活性发现二者变化趋势基本一致，说明表达量与酶活性呈一定的线性关系。实验最终确定培养基条件为葡萄糖9 g/L、蛋白胨16 g/L、硫酸铵4.0 g/L、磷酸氢二钠2.0 g/L、磷酸二氢钾3.0 g/L、氯化钠6.0 g/L；最佳诱导条件为37 ℃下加入0.6 mmol/L诱导剂（IPTG）诱导4 h结束发酵。通过验证使用以上条件下培养最终得到的菌OD600可达到6.63，转氨酶可溶表达量约占可溶蛋白总量的50%，转氨酶活性可达758 U/L。