基于新型香豆素苯甲酰腙的Zn2+荧光探针研究

2019-05-14夏胜涛徐珍香李洪启

生物化工 2019年2期

夏胜涛，徐珍香，李洪启＊

（1.东华大学化学化工与生物工程学院，上海 201620；2.蓬莱新光颜料化工有限公司，山东蓬莱 265601）

锌是生物体内第二丰富的过渡金属[1]，在酶的调控、神经信号传递、基因表达等[2-4]各种生理过程中都发挥着重要的作用，是人体必不可缺少的一种微量元素[5]。尽管大多数生物体中的锌离子与蛋白质紧密地结合，但在某些细胞中“游离锌”仍然有存在的可能，生活中部分严重生理疾病与锌离子的失衡密密相关，如阿尔茨海默病、肌萎缩性侧索硬化症（ALS）、帕金森病、脑缺血和癫痫等[6-10]。因此，对Zn2+离子特定检测方法引发也来越多的人关注，到目前为止，锌离子的研究已经取得了显著的进展。

传统的Zn2+检测方法只适用于生物体外的Zn2+检测，对生物体内的Zn2+很难有效果。新型检测方法荧光分析法在这方面尤为突出，它不仅能突破传统方法的局限，而且还具有高选择性、高灵敏性和良好生物适用性等优点，因此，设计和合成出新的Zn2+探针具有重要的意义[11]。此外，香豆素类衍生物本身不仅具有较长共轭结构，荧光效果好而且具有Stokes位移大、高荧光量子产率、光稳定性好等优良的光学特性[12-14]，能很好作为一种荧光基团，香豆素类衍生物在荧光探针方向的研究成为探针方向的主题，这方面的报道也越来越多。基于以上这两点，本文设计了一种香豆素类席夫碱Zn2+的荧光探针，该探针对Zn2+具有较好的选择性和灵敏性，且体系的荧光强度随着Zn2+浓度增大而增强，在一定的浓度范围内呈线性关系。

本文以间苯二酚和苯甲酰乙酸乙酯为原料合成4-苯基-7-羟基香豆素（1），再在乌洛托品与醋酸条件下合成4-苯基7-羟基-8-甲酰基香豆素（2），最后与苯甲酰肼反应合成4-苯基-7-羟基-8-(苯甲酰腙基)香豆素（L），化合物的合成路线如图1所示。

图1 化合物L的合成路线

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

PY-1型熔点仪（天津市国铭医药设备有限公司）、Bruker AM400型核磁共振仪（德国Bruker公司）、Fluoromax-4荧光测试仪（HORIBA Scientific公司）、UV-1700紫外可见分光光度计（日本岛津）。

间苯二酚、硫酸、冰醋酸、乌洛托品，均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司；苯甲酰乙酸乙酯、苯甲酰肼，均为分析纯，购自上海泰坦化学有限公司；甲醇，分析纯，购自上海实验试剂有限公司；对甲苯磺酸一水合物，分析纯，购自阿拉丁公司。

1.2 化合物L的合成

1.2.1 4-苯基-7-羟基香豆素的合成

将70 mL甲醇逐滴加入到30 mL浓硫酸中，得到无色透明溶液。将间苯二酚（5.5 g，50 mmol）溶于上述100 mL溶剂中，升温至60℃，在磁力搅拌下使其完全溶解，然后用恒压滴液漏斗缓慢滴加苯甲酰乙酸乙酯（9.7 g，50 mmol），滴加完毕后继续加热搅拌4 h。反应结束，冷却至室温，加入冰水，有大量黄色固体析出，静置后抽滤，将滤饼放入真空干燥箱中干燥，用乙醇重结晶后得到淡黄色固体9.76 g，产率为 82%，m. p. 249～ 251 ℃（文献值[15]：250.2～250.5℃）。

1.2.2 4-苯基-7-羟基-8-甲酰基香豆素的合成

将4-苯基-7-羟基香豆素（1.19 g，5 mmol）和乌洛托品（7.0 g，50 mmol）溶于20 mL冰乙酸，水浴加热升温至90℃，搅拌反应6～8 h后，加入24 mL的17% HCl水溶液继续反应10 min，待反应结束，冷却至室温，将反应液倒入到40 mL蒸馏水中，有大量黄棕色固体析出。静置后抽滤，干燥，用乙醇重结晶后得到黄绿色固体0.8 g，产率为60%。m. p.120～122℃（文献值[16]：120℃）。

1.2.3 4-苯基-7-羟基-8-苯腙基香豆素（L）的合成

将4-苯基-7-羟基-8-甲酰基香豆素（1.33 g，5 mmol）、苯甲酰肼（0.68 g， 5 mmol）和对甲苯磺酸（5 mg， 0.025 mmol）溶于30 mL乙醇中，80℃下磁力搅拌回流4 h，TLC跟踪反应进程。反应结束后，冷却至室温，底部有浅黄色固体析出，抽滤，干燥，得到化合物L粗品。采用硅胶柱层析对产物进行提纯，洗脱剂PE∶EA=10∶1，得到1.35 g浅黄色固体，产率为70%，m. p. 262～264℃。1H NMR (DMSO, 400 MHz),δ:12.91 (s, 1H); 12.50 (s, 1H);9.21 (s, 1H); 8.00 (d, J=7.3 Hz, 2H); 7.64～7.67 (m,1H); 7.58～7.60 (m, 5H); 7.53～7.54 (m, 2H); 7.37(d, J=8.9 Hz, 1H); 6.95 (d, J=9.0 Hz, 1H); 6.28 (s, 1H)。13C NMR (DMSO, 100 MHz), δ:162.51, 161.24, 159.06,155.48, 153.17, 143.47, 134.84, 132.31, 132.01, 129.70,129.30, 128.85, 128.63, 128.43, 127.63, 113.76, 110.90,110.52, 106.02; HRMS, C23H17N2O4, 实测值（计算值）,m/z:385.1180(385.1183)[M+H]+。

2 结果与分析

2.1 探针L的离子选择性实验

在CH3CN∶H2O=9∶1（v∶v）溶液中，探针分子L和金属离子的浓度为40 μmol/L，识别对象为13种常见的金属离子（Cu2+、Cr3+、Hg2+、Zn2+、Ni2+、Co2+、K+、Li+、Al3+、Fe2+、Sr2+、Ag+、Fe3+）。如图2所示，当激发波长λex=380 nm，发射波长为λem=495 nm时，Zn2+可使探针L的荧光强度增强8倍左右，Hg2+可使探针L的荧光强度增强4倍，而其他金属离子对探针L的荧光强度没有产生显著的影响。

图2 探针L对金属离子的选择性

2.2 探针L的滴定实验

在CH3CN∶H2O=9∶1（v∶v）溶液中，探针分子L的浓度不变为20 μmol/L，然后逐渐加大Zn2+浓度（0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0、14.0、16.0、18.0、20.0μmol/L和 40.0 μmol/L），如图3所示，探针L随着Zn2+浓度增加，荧光强度逐渐增强，达到40 μmol/L时，荧光强度达到最大值，增强约10倍，如图4所示探针L在加入0～40 μmol/L Zn2+后具有良好的线性相关，相关系数为R2=0.9779。

图3 探针L随Zn2+浓度增加的荧光强度变化

2.3 探针L的离子抗干扰性实验

在CH3CN∶H2O=9∶1（v∶v）溶液中，探针分子L和Zn2+的浓度为40 μmol/L，再加入其他金属离子40 μmol/L，如图5所示，标注为I的表示每种金属离子分别对探针L荧光强度的影响，标注为II的表示加入等浓度的Zn2+后各金属离子对探针L荧光强度的影响。研究发现，当溶液中Zn2+与其他金属离子共存时，溶液的荧光强度均会增强，尤其是Cu2+、Ni2+、Co2+、Fe2+、Fe3+这几种金属离子与 Zn2+共存时，对体系荧光强度影响较大，导致不能很好地检测Zn2+，所以该探针的抗离子干扰性较差，离子共存后灵敏性受到了一定的影响。

图4 探针L荧光强度与Zn2+浓度线性图

图5 不同金属离子对探针L检测Zn2+的干扰性

2.4 pH对探针L稳定性实验

在CH3CN∶H2O=1∶9（v∶v）溶液中，探针分子L和Zn2+的浓度为10 μmol/L时，测定了pH对探针L识别Zn2+的影响。图6为酸性条件下，不同pH值对溶液荧光强度的影响，发现探针L最大发射波长从495 nm红移到515 nm，随着pH值的升高，溶液荧光强度逐渐增强，当pH=7时，达到最大值；pH=1或2时，探针L荧光强度极低，探针L稳定性差。图7为碱性条件下，不同pH值对溶液荧光强度的影响，发现探针L最大发射波长从495 nm红移到515 nm；pH = 12、13或14时，探针L荧光强度极低，探针L稳定性差。据此可知探针L耐酸和耐碱性能较差，在强酸或强碱条件下稳定性差。

图6 酸性条件下L识别Zn2+荧光强度变化

2.5 探针L的Job曲线实验

利用Job配合曲线法进一步测定了探针L与Zn2+的配合情况。探针L和Zn2+浓度都为20 μmol/L且保持探针L与Zn2+的总浓度为2×10-5mol/L，然后逐渐改变探针L与Zn2+的物质的量比（0.1～0.9），分别测定其荧光强度，以荧光强度F对物质的量比作图得到Job曲线，如图8所示，探针L与Zn2+形成1∶2的配合物。