秦康，朱智甲，孟爽，孟丽媛＊

（1.东华大学 化学化工与生物工程学院，上海201620；2.上海交通大学医学院 基础医学公共技术平台，上海200025）

Fbxw7α，又被称为FBW7、AGO、SEL10、CDC4，是SCF（Skp1-Cullin-F-box protein）蛋白泛素连接酶复合物的底物结合组分[1]，它可以靶向泛素化介导降解许多原癌基因，包括MCL-1、Notch、Myc、Jun、Cyclin E和mTOR。Fbxw7α的功能丧失性突变或缺失会诱导有利于肿瘤生长的癌基因的过表达，常见于各种类型的人类癌症，包括乳腺癌、结肠癌、胰腺癌和T型急性淋巴细胞白血病（T-ALL）[2-3]。例如，在T-ALL中发现Fbxw7α发生R465H，R479L或R505C突变[3]，小鼠造血干细胞中Fbxw7α的缺失会导致T细胞恶性肿瘤[4]，这些都证明Fbxw7α是一种肿瘤抑制因子。

Fbxw7蛋白具有Fbxw7α、Fbxw7β和Fbxw7γ三种，它们亚型结构相同、功能相似，但亚细胞定位不同。Fbxw7α定位于核浆，Fbxw7β定位于细胞质，而Fbxw7γ定位在核仁内[5]，它们是从5'端10个外显子中不同的外显子翻译而来[6]。Fbxw7蛋白包含F-box结构域、WD重复结构域和D结构域，F-box结构域是与SCF（Skp1-Cullin-F-box protein）复合体中的Skpl或Skpl类似蛋白结合的区域，WD重复结构域用来介导与底物蛋白的特异性识别，D结构域是Fbxw7二聚化结合部位。

有报道证明，P53可以上调Fbxw7β的表达，并且与P53潜在的结合位点存在于人的Fbxw7的外显子1b中[7]，表明Fbxw7是转录因子P53蛋白的转录靶标。最近，有人报道了Fbxw7和P53对龋病发生的协同作用[8]。例如，P53突变体经常在携带天然Fbxw7突变体的癌症中发现[9]。在T淋巴母细胞性淋巴瘤中，Fbxw7基因的杂合性缺失经常以Tp53依赖性方式发生[10]。Fbxw7突变的结直肠癌细胞中的P53表现出高水平的丝氨酸-15磷酸化[9]。尽管有这些研究结果，Fbxw7α和P53之间的相互作用尚未明确证实。在本研究中，进行了免疫共沉淀联合LC-MS/MS分析，并且比较了野生型（WT）Fbxw7α和F-box结构域缺失的Fbxw7α突变体（ΔFbxw7α）之间的相互作用蛋白。发现并验证了P53蛋白与Fbxw7α蛋白的相互作用，并揭示了Fbxw7α与P53在细胞周期调控中的直接联系。

1 材料与方法

1.1 材料

细胞与菌种：293T细胞，DH5α、BL21感受态细胞；试剂：K+、IPTG、各种酶及各种分析纯试剂等；抗体：flag，cul1，skp1，Fbxw7α，P53，HA，Actin，Mcl-1抗体。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养

本研究主要采用的细胞系是人肾上皮细胞系293T细胞，培养在加入了10%的胎牛血清的DMEM培养基中。细胞来源于上海交通大学医学院病理生理学教研室细胞分化与凋亡国家教育部重点实验室，在5% CO2的培养箱37 ℃培养。

1.2.2 质粒构建与点突变

使用QuikChangeTM定点诱变试剂盒（Stratagene，Palo Alto，CA）构建具有定点突变体表达蛋白的质粒。

1.2.3 免疫共沉淀分析（Co-IP）

收集表达带有HA-P53或Flag-Fbxw7α标签蛋白的293T细胞，进行超声破碎，取上清，使用HA或Flag抗体及protein A/G对表达带有HA或Flag标签蛋白的293T细胞进行免疫共沉淀。

1.2.4 激光共聚焦免疫荧光分析

在六孔板底部放入灭菌后的盖玻片，加入适宜密度的293T细胞，待细胞稳定贴壁后，进行固定、打孔处理，随后用不同抗性的P53及Fbxw7α抗体孵育，再用不同颜色对应二抗孵育，最后加DAPI封片，进行激光共聚焦显微镜观察。

1.2.5 细胞周期分析

收集293T细胞，洗涤后用75%冷乙醇重悬并在-20 ℃下固定，再次洗涤后用100 μg/mL RNase A处理细胞，并用25 μg/mL碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）染色，通过流式细胞仪测定细胞周期分布。

1.2.6 质谱分析

来自免疫沉淀的蛋白质样品送至上海交通大学医学院基础医学公共技术平台蛋白质组学实验室进行前处理及LC-MS/MS分析，使用Easy-nLC 1000h和LTQ orbitrap“XL”高分辨纳升级液相质谱联用系统进行肽段序列分析，最后通过与数据库进行比对对蛋白质进行鉴定。数据库搜索和数据分析的所有MS/MS离子光谱均由ProteoWizard msConvert提取，并使用Mascot（Matrix Science, London, UK；版本2.4.1）进行分析。

2 结果与分析

2.1 鉴定293T细胞中Fbxw7α相互作用蛋白

为了识别可能与Fbxw7α直接相互作用但不被SCF复合物的其他成分募集的蛋白质，本实验转染了标志野生型（WT）Fbxw7α或Flag-F-box缺失的Fbxw7α突变体（ΔFbxw7α），其不能形成SCF与293T细胞中的Cullin1[11-12]复合，用抗Flag M2树脂进行亲和沉淀，然后通过LC-MS/MS鉴定。如图1所示，两种蛋白均有很多与其相互作用的蛋白，Flag-WT Fbxw7α而不是F-box缺失的ΔFbxw7α突变体可以更有效地拉下SCF复合物的一些关键分子支架，如SKP1和Cullin1，这表明Flag-IP分析法可以有效分离Fbxw7α相互作用蛋白。从图中发现，与Fbxw7α及ΔFbxw7α相互作用的蛋白质中都有P53蛋白。

图1 免疫共沉淀联合LC-MS/MS寻找在293T细胞中与Flag-Fbxw7α和Flag-ΔFbxw7α相互作用蛋白的热图

2.2 Fbxw7α与P53的具有相互作用

通过免疫沉淀（IP）分析293T细胞内源性P53和转染过表达的Flag标记的WT-Fbxw7α，F-box缺失的 Fbxw7α（ΔFbxw7α）或突变体 Fbxw7α（R465、R479和R505）之间的相互作用，如图2所示，用Flag抗体进行IP，蛋白免疫印迹显示WT-Fbxw7α和ΔFbxw7α都有P53拉下来，而未转入Flag-Fbxw7α及其3种突变体则没有明显的P53拉下来。同样，HA抗体可以在与HA-P53和Flag-Fbxw7α共转染的293T细胞中共沉淀Fbxw7α蛋白（图3）且情况与Flag抗体进行的共沉淀相同。这说明P53与Fbxw7α有相互作用且发生在Fbxw7α的WD40结构域。此外，图中还显示了F-box结构域缺失的Fbxw7α确实不能与Cullin1及SKP1发生相互作用，因此不形成SCF复合物，但却显示出与P53的强烈相互作用，而WD40 结构域上的点突变则会影响它们之间互作用形成SCF复合体。

图2 用Flag抗体检测不同处理的Flag-Fbxw7α蛋白对内源P53蛋白的免疫共沉淀情况

图3 用HA抗体检测HA-P53蛋白对不同处理的Flag-Fbxw7α蛋白的免疫共沉淀情况

通过对293T细胞中内源性P53和Fbxw7α免疫荧光染色，发现内源性P53和Fbxw7α具有共定位现象，如图4所示，这也证明了Fbxw7α与P53具有相互作用。

2.3 Fbxw7α不会降解P53

为了评估P53是否是Fbxw7α通过SCF作用的底物，在293T细胞中转染一组不同剂量的Fbxw7α并用蛋白酶体抑制剂MG132处理细胞，结果如图5所示。在蛋白酶体抑制剂MG132存在下，P53蛋白质增加，但外源性Fbxw7α的表达对其几乎没有影响。在不存在MG132的情况下，随着Fbxw7α表达量的增加，P53蛋白量并没有减少。而MCL-1是已知明确的SCF通过Fbxw7α降解的蛋白，如图5所示，随着Fbxw7α蛋白的增加，MCL-1明显减少，而加入MG132后则有明显增加的现象。这些数据表明P53不是Fbxw7α用于蛋白酶体降解的直接靶标，尽管它作用于Fbxw7α的底物相互作用结构域（图2和图3）。

图4 293T细胞中蛋白P53和Fbxw7α的免疫荧光染色

图5 不同表达量的Flag-Fbxw7α及蛋白酶体抑制剂MG132对P53蛋白表达量的影响

2.4 Fbxw7α过表达会使细胞阻滞在G1期

由于P53能够影响许多细胞周期相关基因的表达，推测Fbxw7α可能通过与P53相互作用从而调节细胞周期。使用双胸苷阻断，然后使用诺考达唑阻断使细胞阻断在G2/M期，并使用流式细胞术分析监测细胞从G2/M期的进展。结果如图6所示，诺考达唑释放后12 h，转染EV和Fbxw7α-R479L的293T细胞中73.6%和85.2%的细胞进入S期，而转染Fbxw7α和ΔFbxw7α的293T细胞分别为61.3%和57.7%，表明Fbxw7α的表达使细胞周期阻滞在G1期，但是这是否与P53相关有待进一步研究。

3 结论

本文通过293T细胞中的免疫共沉淀联合LC-MS/MS观察到了P53和Fbxw7α之间的相互作用。为了确定是与Fbxw7α直接相互作用而不是通过SCF的其他成分相互作用的蛋白，在293T细胞中转染野生型Fbxw7α以及F-box缺失的Fbxw7α突变体（ΔFbxw7α）并分选与这两种形式的Fbxw7α相互作用的蛋白质。随后，通过免疫荧光和蛋白免疫共沉淀试验证明了P53和Fbxw7α之间的直接相互作用。而且，Fbxw7α的表达没有诱导P53蛋白的降解，表明P53不能通过与Fbxw7α相互作用从而通过SCF降解。考虑到P53的磷酸化及其降解与Fbxw7α高度相关，它们两者之间的相互作用是否依赖于P53的磷酸化值得进一步研究。另一方面，P53和Fbxw7α之间的相互作用对MDM2介导的P53降解的影响可能为解释Fbxw7α对P53的作用提供一些线索。

图6 流式细胞术分析不同293T细胞的细胞周期

总之，本文证明了Fbxw7α和P53之间的直接相互作用，并且不介导P53的降解。另外，Fbxw7α的过表达会使细胞周期阻滞在G1期，但是这是否与P53相关有待进一步研究，这可能会揭示Fbxw7α调节细胞周期的新机制。