李敏，敬小莉，谈文林

（1.达州职业技术学院，四川达州 635000；2.四川文理学院 化学化工学院，四川达州 635000）

何首乌作为传统的大宗中药材，具有极高的药用价值。其根部入药，具有活络、养血、安神、消痈、解毒（截疟）等功效[1-3]。研究发现，何首乌中主要含有二苯乙烯苷类、蒽醌类、磷脂类和黄酮类等具有生物活性和药理作用的化合物[4-5]。二苯乙烯苷（2,3,5,4'-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷）是何首乌的主要药效成分，具有抗氧化、抗衰老、抗老年痴呆、保肝护肝、增强免疫力、降低胆固醇和防止动脉硬化等药理作用[6-7]，其含量作为何首乌及其制剂的质量评价指标[8]。目前，对何首乌中二苯乙烯苷类物质的研究主要集中在提取方法及提取物的活性研究方面，对于何首乌中二苯乙烯苷的分离纯化及其抗氧化活性方面研究较少。因此发展一种能将提取液进行分离纯化，并将纯化产物用于有针对性的抗氧化活性研究具有十分重要的现实意义。

大孔吸附树脂是近几年发展起来的一种具有高效吸附性能的有机聚合物吸附剂，具有化学性能稳定、选择性高、再生简单和高效节能等优点，广泛应用于天然产物的分离纯化工艺[9-10]。本文以四川达州产何首乌为研究对象，通过超声波辅助提取技术提取何首乌中二苯乙烯苷类物质，采用大孔吸附树脂对二苯乙烯苷类物质进行分离纯化，并对大孔吸附树脂进行了筛选，为二苯乙烯苷类物质的工业化生产提供技术依据。将分离纯化产物进行抗氧化活性研究，检测何首乌中二苯乙烯苷类物质对·OH和DPPH·的清除能力，以及还原力测定，为深入开发利用四川达州产何首乌提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

何首乌（40 ℃条件下干燥后粉碎过60目筛）：四川达州产；二苯乙烯苷标准品：中国标准物质中心；S-8、NKA-9、D101、D201、D301、AB-8、DM-130型大孔吸附树脂：上海源叶生物科技有限公司；二苯代苦味肼基自由基（DPPH·）：美国Sigma公司；六氰合铁酸钾（K3[Fe(CN)6]）、抗坏血酸（Vc）、水杨酸、硫酸亚铁（FeSO4）：国药集团；其他试剂均为分析纯；实验用水为超纯水。

1.2 仪器与设备

UV-2550紫外可见分光光度计（日本岛津公司）、SHZD3000型多功能全自动振荡仪（上海电气有限公司）、DZX-6022B真空干燥箱（上海福玛实验设备有限公司）、RE-2000B旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）、FS-900N超声波中药提取仪（上海科祁仪器设备有限公司）、FA1004N电子分析天平（上海菁华科技仪器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 标准曲线的绘制

准确称取二苯乙烯苷标准品5.0 mg，用无水乙醇溶解后定容至25 mL，即得200 mg/L二苯乙烯苷标准品溶液。分别精密吸取200 mg/L二苯乙烯苷标准品溶液0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL和3.5 mL置于8个25 mL容量瓶中，用无水乙醇定容，分别测定不同浓度在322 nm下的吸光度，测定3次取平均值，以吸光度A（Abs）为纵坐标，二苯乙烯苷浓度C（mg/L）为横坐标作图，得二苯乙烯苷标准曲线，如图1所示。线性回归方程y=0.0567x+0.0083，相关系数R为0.9999，通过测定样品溶液的吸光度，以此标准曲线方程计算样品溶液中二苯乙烯苷类物质的含量（mg/L）。

图1 二苯乙烯苷标准曲线

1.3.2 样品中二苯乙烯苷类物质的提取、测定及上柱液的制备

二苯乙烯苷类物质的提取及测定根据文献[11]方法改进，称50.0 g的何首乌粉末，以体积分数60%的乙醇作溶剂，料液比为1∶25（g∶mL），采用800 W超声提取，在65 ℃下提取1.5 h，重复2～3次，将提取液过滤，即得待测液。由于1.3.1中二苯乙烯苷标准品在322 nm波长下有特征吸收峰，因此取适量待测溶液于322 nm下测定吸光度，根据二苯乙烯苷标准曲线方程得到二苯乙烯苷类物质的浓度（C），按公式（1）计算苯乙烯苷类物质提取率为7.83%。将提取液减压浓缩，蒸干得二苯乙烯苷粗提物，根据1.3.1中方法对二苯乙烯苷的纯度进行测定，粗提物二苯乙烯苷类物质纯度为34.62%，将粗提物用适量无水乙醇溶解，即得上柱液。

其中：C表示二苯乙烯苷类物质的浓度，g/mL；V表示样品的体积，mL；M表示何首乌质量，g。

乔治·华盛顿大学儿童心理学教授葛林斯班认为：“感情能力不只是未来发展亲密关系与依赖的基石，也是智能与许多认知能力的基础。在孩子不同的发展时期，感情能力都扮演主导的角色，学习与认知技巧则跟随其后。即使是数学能力，表面看来是与个人无关，是绝对属于认知技巧的领域，其实也是透过感情来学习。例如：‘很多’对一个2岁的孩子而言，指的是超乎他所预期的；‘很少’是指比他想要的还少。”

1.3.3 大孔吸附树脂预处理与再生

将市售大孔吸附树脂用无水乙醇浸泡24 h，使其充分溶胀，用适量乙醇洗至流出液与蒸馏水1∶5混合无浑浊现象，再用5%的盐酸浸泡2～4 h，用水洗至中性，最后用5%的氢氧化钠溶液浸泡2～4 h，用水洗至中性，大孔吸附树脂完成预处理。实验使用过的大孔吸附树脂，先用5%盐酸浸泡2～4 h，用水洗至中性，最后用5%氢氧化钠浸泡2～4 h，用水洗至中性，大孔吸附树脂即可再次使用。

1.3.4 大孔吸附树脂吸附-解吸实验

准确称取5.0 g预处理过的干大孔吸附树脂，装入锥形瓶中，加入已知浓度的何首乌二苯乙烯苷提取液50 mL，以120次/min的速度在室温下振荡48 h，大孔吸附树脂充分吸附二苯乙烯苷后，取上层清液测定二苯乙烯苷类物质的浓度，按公式（2）、（3）计算大孔吸附树脂对二苯乙烯苷类物质的吸附量（Q1）和吸附率（E）[12]。

其中：Q1表示吸附量，mg/g；C0表示溶液初始浓度，mg/mL；C1表示完成吸附后溶液浓度，mg/mL；E表示吸附率；M表示大孔吸附树脂的质量，g。

将吸附饱和后的干大孔吸附树脂加入50 mL无水乙醇，以120次/min的速度在室温下振荡48 h，大孔吸附树脂充分解吸二苯乙烯苷后，取上层清液测定二苯乙烯苷类物质的浓度，按公式（4）、(4)计算大孔吸附树脂对二苯乙烯苷类物质的解吸量（Q2）和解吸率（D）[13]。

其中Q2表示解吸量，mg/g；C2表示解吸液浓度，mg/mL；D表示解吸率。

1.3.5 二苯乙烯苷类物质的分离纯化

1.3.6 抗氧化活性测定

1.3.6.1 清除羟基自由基（·OH）活性测定

采用Fenton反应[14-15]，分别取纯化二苯乙烯苷和Vc进行实验，在10 mL比色管中分别加入不同浓度（见图3）的纯化二苯乙烯苷和Vc乙醇溶液1 mL，6 mmol/L的FeSO4溶液1 mL和0.1%的H2O2溶液1 mL，摇匀后静置5 min，然后加入6 mmol/L的水杨酸-乙醇溶液1 mL，用蒸馏水定容，摇匀后在37 ℃水浴30 min，离心后在510 nm处测定其吸光度为A2，再将样品（纯化二苯乙烯苷和Vc）用1 mL的蒸馏水代替，测定其吸光度为A0，将体系中H2O2溶液用1 mL蒸馏水代替，测定其吸光度为A1，按公式（6）计算纯化二苯乙烯苷和Vc对·OH的清除率。

其中：E表示清除率；A0表示未加样品的吸光度；A1表示未加双氧水的吸光度；A2表示加入样品的吸光度。

1.3.6.2 清除DPPH·活性测定

分别取纯化二苯乙烯苷和Vc进行实验，在10 mL比色管中分别加入不同浓度（见图4）的纯化二苯乙烯苷和Vc乙醇溶液2 mL和0.2 mmol/L的DPPH·乙醇溶液2 mL，用无水乙醇定容后摇匀，室温避光静置30 min，在517 nm处测定其吸光度为A2，再将样品（纯化二苯乙烯苷和Vc）用2 mL无水乙醇代替，测定其吸光度为A0，将体系中DPPH·乙醇溶液用2 mL无水乙醇代替，测定其吸光度为A1，按1.3.6.1方法计算纯化二苯乙烯苷和Vc对DPPH·的清除率。

1.3.6.3 还原力测定

分别取纯化二苯乙烯苷和Vc进行实验，在25 mL容量瓶中分别加入不同浓度（见图5）的纯化二苯乙烯苷和Vc乙醇溶液2.5 mL，1.0%六氰合铁酸钾溶液2.5 mL和0.2 mol/L磷酸盐缓冲溶液（pH=6.6）2.5 mL，摇匀后50 ℃水浴20 min，冷却后加入10%醋酸2.5 mL和0.1%氯化铁溶液2.5 mL，用蒸馏水定容，摇匀后静置10 min，离心后在700 nm处测定其吸光度，在相同浓度条件下，纯化二苯乙烯苷和Vc比较，吸光度越大，其还原力越强。

2 结果与分析

2.1 大孔吸附树脂的筛选

依据1.3.4方法，将大孔吸附树脂S-8、NKA-9、D101、D201、D301、AB-8、DM-130用于何首乌中二苯乙烯苷类物质的静态吸附-解吸实验，实验结果见表1。从实验数据可知，不同种类树脂的吸附率和解吸率不同。从吸附率的数据可以看出，NKA-9树脂吸附率最高；从解吸率的数据可以看出，S-8树脂解吸率最高，NKA-9树脂次之，但两者差别不大。从表1中数据综合考虑吸附-解吸效果，NKA-9树脂效果最好，因此选择NKA-9树脂对何首乌中二苯乙烯苷类物质进行分离纯化。

表1 吸附-解吸实验结果

2.2 NKA-9大孔树脂吸附实验

在单因素实验的基础上，以二苯乙烯苷上样液浓度（A）、上样速度（B）、上样量（C）和乙醇浓度（D）四因素为变量，进行L9(34)正交试验，方案设计见表2所示。

表2 因素水平表

以NKA-9大孔树脂对二苯乙烯苷的吸附率为评价指标，对上样液浓度（A）、上样速度（B）、上样量（C）和乙醇浓度（D）进行正交实验优化，实验结果见表3。

表3 正交实验结果

从表3的极差分析可知，树脂吸附效果的影响大小顺序为：A＞C＞B＞D，即二苯乙烯苷上样液浓度（A）对吸附率影响最大，其次是上样量（C）和上样速度（B），最后是乙醇浓度（D）。由k值得出NKA-9大孔树脂对二苯乙烯苷的最佳吸附条件为：A2B2C2D1，即上样液浓度为3.5 mg/mL、上样速度为3.0 BV/h、上样量为3.0 BV和乙醇浓度70%。

2.3 NKA-9大孔树脂解吸实验

在二苯乙烯苷解吸过程中，首先用石油醚和乙酸乙酯混合液（体积比2∶1）洗脱，除掉二苯乙烯苷粗提物中的极性较小的挥发油、脂类和色素等，再用无水乙醇以流速3.0 BV/h洗脱，TLC监测，按BV收集洗脱液，按1.3.1方法测定各段洗脱液二苯乙烯苷的含量（mg/mL），得到解析曲线，实验结果图2所示。

由图2可知，在收集的各段洗脱液中，随着洗脱液体积的增加，二苯乙烯苷的含量先增加再降低，到第4BV洗脱液时，二苯乙烯苷已基本洗脱完全，因此可以确定选用洗脱液用量为4BV进行解吸。

图2 大孔树脂解吸曲线

2.4 清除羟基自由基（·OH）作用

以纯化二苯乙烯苷和Vc对羟基自由基（·OH）的清除作用比较，设计对比实验，其实验结果如图3所示。

图3 二苯乙烯苷和Vc对·OH的清除能力

由图3可知，在所选实验质量浓度范围内，纯化二苯乙烯苷和Vc随着浓度的增加，清除羟基自由基（·OH）的能力不断增强，当浓度达到一定值时，清除率趋于稳定。其中纯化二苯乙烯苷浓度为35 mg/L时，纯化二苯乙烯苷对·OH的清除率达到72.72%，说明纯化二苯乙烯苷对羟基自由基（·OH）有较好的清除能力。

2.5 清除DPPH·作用

以纯化二苯乙烯苷和Vc对DPPH·的清除作用比较，设计对比实验，其实验结果如图4所示。

由图4可知，在所选实验质量浓度范围内，纯化二苯乙烯苷和Vc随着浓度的增加，清除DPPH·的能力不断增强，当浓度达到一定值时，清除率趋于稳定。其中纯化二苯乙烯苷浓度为14 mg/L时，纯化二苯乙烯苷对DPPH·的清除率达到78.73%，结果表明，纯化二苯乙烯苷对DPPH·有较好的清除能力。

图4 二苯乙烯苷和Vc对DPPH·的清除能力

2.6 还原力分析

一般而言，物质的还原力与抗氧化能力之间具有相关性，物质的抗氧化能力越强，还原力越强。以纯化二苯乙烯苷和Vc对Fe3+的还原力比较，设计对比实验，其实验结果如图5所示。

图5 二苯乙烯苷和Vc的还原力

还原力测试实验是根据Fe3+被还原为Fe2+，纯化二苯乙烯苷和Vc还原六氰合铁酸钾后，生成普鲁士蓝，在700 nm处出现最大吸收。由图5可知，在所选实验质量浓度范围内，纯化二苯乙烯苷和Vc的还原力随着浓度的增加而增大，在相同浓度条件下，纯化二苯乙烯苷的还原力约为Vc的40%，虽然纯化二苯乙烯苷的吸光度值低于Vc，但纯化二苯乙烯苷也表现出了较强的还原力。

3 结论

本实验通过超声波提取技术，从何首乌中提取得到了二苯乙烯苷类物质，提取率为7.83%，粗提物二苯乙烯苷类物质纯度为34.62%。通过对大孔吸附树脂的吸附-解吸实验考察，筛选出了效果最佳的NKA-9树脂；采用石油醚、乙酸乙酯和无水乙醇对何首乌二苯乙烯苷类物质粗提物进行梯度洗脱，TLC监测，制备得到纯化二苯乙烯苷类化合物，纯度为72.68%。通过纯化二苯乙烯苷类化合物与Vc抗氧化活性和还原力比较研究，二苯乙烯苷类物质对·OH和DPPH·的清除率分别达到72.72%和78.73%，还原力约为同浓度Vc的40%，实验结果表明，何首乌中二苯乙烯苷类物质具有较好的抗氧化活性和较强的还原能力。