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流行性感冒(流感)是呼吸道传播的传染性疾病，可造成世界范围内的广泛流行，据估计每年流感流行导致全球近50万人死亡，是第一个实行全球性监测的传染病[1]。根据流感病毒内部蛋白抗原性的不同，可分为A、B、C三个型。B型流感病毒有其独特的演化特点，包括编码蛋白NB、蛋白长度和基因组的非编码区的长度等[2]。

自1983年以来，B型流感病毒根据其抗原性和基因特性分为两大谱系，简称为Yamagata系和Victoria系[3]。与A型流感病毒相比，B型更倾向于在儿童和老年人群体中流行，常导致多种并发症和死亡病例，疾病负担甚至超过A型[4-5]。目前，应用于临床抗流感病毒药物主要分为两类: 一类为M2离子通道抑制剂，也称金刚烷胺类；另一类为神经氨酸酶抑制剂(NAI)，如奥司他韦、扎那米韦等。由于B型流感病毒缺乏M2蛋白，因此仅有神经氨酸酶抑制剂对其有效[6]。在NA活性部位或者邻近活性部位的氨基酸发生替换就有可能导致病毒对NAI的敏感性降低，影响NAI的治疗效果。目前，很少见到国内关于耐药毒株的报道。

本研究分析了2017-2018流感监测年度山东省B型流感病毒对神经氨酸酶抑制剂的药物敏感性，同时分析了B型流感病毒NA基因的分子进化及耐药突变位点，为山东省B型流感的防控提供一定的参考。

1 材料与方法

1.1毒株来源 所有流感毒株均来自山东省流感监测网络实验室。依据《全国流感监测方案(2017版)》，每年4月1日所在周至次年4月1日所在周前一周为一个流感监测年度，因此2017-2018流感监测年度流感毒株的采样日期为2017年4月3日至2018年4月1日。在此期间，山东省疾控中心收检B型流感病毒1664株(Yamagata系1646株，Victoria系18株)。Yamagata系病毒在B型流感病毒中占绝对优势。根据病毒的采样日期和分离地点随机选取了16株Yamagata系和2株Victoria系病毒用于本研究。神经氨酸酶抑制试验中使用的药物敏感参考毒株B/Rochester/02/2001(D198)和耐药参考毒株B/Rochester/02/2001(D198N)均由中国疾病预防控制中心提供。

1.2神经氨酸酶抑制试验 利用ABI公司的NA-FluorTMInfluenza Neuraminidase Assay Kit，采用荧光法对病毒进行生物学耐药试验[7-8]。实验中使用的奥司他韦和扎那米韦由中国疾控中心提供。使用GraphPad Prism 5计算半数抑制浓度IC50(神经氨酸酶活性被抑制50%时的药物浓度)。对参考毒株进行3次独立实验后取其平均值作为参考株的IC50值。

根据WHO制定的标准对试验结果进行判断：对于B型流感病毒，当待检病毒IC50值<5倍NAI敏感株的参考株IC50值时则表示病毒对所检测的NAI药物敏感；当5倍NAI敏感株的参考株IC50值≤待检病毒IC50值≤50倍NAI敏感株的参考株IC50值时则表示病毒对所检测的NAI药物敏感性降低；当待检病毒IC50值>50倍NAI敏感株的参考株IC50值时则表示病毒对所检测的NAI药物敏感性高度降低[9]。

1.3 序列测定及分析

1.3.1核酸提取及神经氨酸酶基因扩增 所有参与耐药实验检测的流感病毒，均使用Qiagen公司的QIAamp Viral RNA Mini Kit试剂盒(Lot 74104)对流感病毒细胞培养液进行核酸提取，然后用Qiagen公司One Step RT-PCR Kit(Lot 210212)进行基因扩增。扩增引物由国家流感中心提供，序列如下(5′-3′)：

Fragment 1 BNA 1-F AGCAGAAGCAGAGC-ATCTTC，BNA 1-R GATAACAATYTCCYCCGATGC，

Fragment 2 BNA 2-F AAGAAAGTGCYTG-YAATTGCA，BNA 2-R AGTAGTAACAAGAGCAT

PCR反应条件：60 ℃ 1 min；42 ℃ 20 min；50 ℃ 20 min；95 ℃ 15 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，循环35次；72 ℃ 10 min；4 ℃保存。

1.3.2序列测定及分析 PCR产物送上海博杰生物工程技术服务有限公司进行双向测定。使用SeqMan软件进行序列拼接，选取2017年WHO推荐的北半球流感疫苗株(B/Brisbane/60/2008(Victoria)，B/Phuket/3073/2013(Yamagata))作为参考株进行序列分析。使用MEGA5.1软件对病毒NA基因的核苷酸序列进行比对并建立遗传进化树，对氨基酸序列进行耐药突变位点分析。

2 结 果

2.1B型Yamagata系流感病毒的神经氨酸酶抑制试验结果 在检测的16株B型Yamagata系流感病毒中，15株病毒均为奥司他韦及扎那米韦的敏感株。有1株病毒(B/shandong-shibei/11199/2017)对奥司他韦和扎那米韦2种药物的敏感性均降低。16株B/Yamagata系毒株对奥司他韦的IC50平均值为22.64 nmol/L(9.24～129.31 nmol/L)，其中B/shandong-shibei/11199/2017对奥司他韦的IC50值为129.31 nmol/L，是B/Rochester/02/2001(D198)药物敏感参考毒株对奥司他韦的IC50平均值(14.43 nmol/L)的8.96倍。16株B/Yamagata系毒株对扎那米韦的IC50平均值为0.57 nmol/L(0.31～2.72 nmol/L)，其中B/shandong-shibei/11199/2017对扎那米韦的IC50值为2.72 nmol/L，是B/Rochester/02/2001(D198)药物敏感参考毒株对扎那米韦的IC50平均值(0.37 nmol/L)的7.35倍。耐药变异株B/Rochester/02/2001(D198N)对奥司他韦和扎那米韦的IC50平均值分别为146.07 nmol/L和3.91 nmol/L。见图1。

2.2B型Victoria系流感病毒的神经氨酸酶抑制试验结果 对奥司他韦敏感的2株B/Victoria系毒株，IC50平均值为14.66 nmol/L(9.24～20.08 nmol/L)，没有检测到对奥司他韦敏感性降低或者敏感性高度降低的毒株。对扎那米韦敏感的2株B/Victoria系毒株，IC50平均值为0.41 nmol/L(0.39～0.44 nmol/L)。没有检测到对扎那米韦敏感性降低或者敏感性高度降低的毒株。见图1。

2.3NA分子进化树以及NA基因氨基酸位点分析

2.3.1NA基因遗传进化分析 氨基酸序列分析显示，与国际疫苗株B/Phuket/3073/2013(Yamagata)相比，16株BY系毒株NA片段共有16处位点发生变异；2株BV系毒株与国际疫苗株B/Brisbane/60/2008(Victoria)相比，NA片段有5处位点发生变异。如表1，2所示。图2为构建的系统进化树，NA基因进化树分为Yamagata系和Victoria系

两大支。其中Yamagata系分支又分为两支，B/shandong-huancui/1691/2017等3株病毒与疫苗株B/Phuket/3073/2013距离较近，其余13株病毒距离疫苗株相对较远。

注：左纵坐标为流感毒株对奥司他韦的IC50值，右纵坐标为流感毒株对扎纳米韦的IC50值。1：药物敏感株B/Rochester/02/2001(D198)，2、3：B型Victoria系毒株，分别对应B/shandong-qixia/36/2017和 B/shandong-huancui/1162/2018，4-19：B型Yamagata系毒株，分别对应表1中从B/shandong-bincheng/3228/2017到B/shandong-shibei/11199/2017(顺序从上到下)，20为药物敏感株B/Rochester/02/2001(D198)的5倍IC50值。

表1 2017-2018年度山东省B型Yamagata系分离株NA氨基酸位点的变化Tab.1 Amino acid mutations in NA proteins of BY lineage influenza viruses in Shandong, 2017-2018

*为2017年世界卫生组织规定的疫苗株

●：疫苗株●：Vaccine virus

表2 2017-2018年度山东省B型 Victoria系分离株NA氨基酸位点的变化Tab.2 Amino acid mutations in NA proteins of BV lineage influenza viruses in Shandong, 2017-2018

2.3.2NA蛋白分子上耐药突变位点的变异情况 流感病毒对NAI类药物产生耐药主要是由于HA的受体结合位点以及NA催化活性中心的位点突变所致。NA酶活性区域由功能部位8个氨基酸(R-118，D-151，R-152，R-224，E-276，R-292，R-371，Y-406)和结构部位11个氨基酸(E-119，R-156，W-178，S-179，D-198，I-222，E-227，H-274，E-277，N-294和E-425)。这些氨基酸在A型和B型流感病毒中均为保守氨基酸，导致NA酶活性区域或者结构部位发生构象变异的突变会影响病毒对NAI的敏感性[10]。序列比对分析发现，所测得的毒株NA基因氨基酸序列只有B/shandong-shibei/11199/2017这一株发生H274Y突变，其他毒株上述位点均保守无突变。这与耐药实验的结果一致，耐药实验也证实这些毒株仍然对NAI类药物敏感，B/shandong-shibei/11199/2017株的对奥司他韦和扎那米韦2种药物的敏感性均降低。

3 讨 论

一直以来，人们对B型流感缺乏足够的重视，但是近来的监测和流行病学数据显示B型流感所带来流行和死亡的疾病负担高于人们的传统认识[11]。据统计，从2004年以来B型流感病毒导致了1%～52%的流感相关的儿童死亡率[12]。人们应对B型流感病毒予以更多的关注。

流感病毒NA是流感病毒重要的表面糖蛋白，具有抗原性，其功能是催化裂解唾液酸使子代病毒释放并防止病毒形成聚集体[13]。NAI作为唾液酸类似物能够通过与NA结合而阻断NA与唾液酸的结合，从而抑制流感病毒的NA活性[14]。随着NAI的广泛使用，一些流感病毒的NA活性位点的氨基酸发生突变，降低了病毒与NAI的结合能力，进而导致病毒对NAI的敏感性降低，使病毒更有利于生存，从而加速病毒的进化速率。本次研究发现，山东省B/Yamagata系毒株相对B/Victoria系毒株对奥司他韦和扎那米韦更敏感(B/Victoria系毒株对奥司他韦和扎那米韦的IC50平均值分别为32.96 nmol/L和1.05 nmol/L，B/Yamagata系毒株对奥司他韦和扎那米韦的IC50平均值分别为16.66 nmol/ L和0.83 nmol/L)。这与中国疾控中心之前的监测结果一致[15]。2007-2008年，全球范围内广泛出现了一种获得了NA基因H274Y突变的季节性H1N1流感病毒[16]，表明对NAI敏感性高度降低的流感病毒可在人群中迅速传播。本次研究中发现的一株B/Yamagata系毒株NA基因具有H274Y位点突变，导致其对奥司他韦和扎那米韦均出现敏感性降低，提示该位点在NA酶活性区域与NAI结合上具有重要作用。2017-2018流感监测年度我省Victoria系流感病毒活动水平较低，主要以Yamagata系为主，而WHO推荐的疫苗组分是Victoria系病毒。由于Yamagata系和Victoria系流感病毒之间缺乏交叉保护，所以本年度WHO推荐的B型流感疫苗组分与我省B型流感优势流行株匹配性不佳。造成这种问题的主要原因是目前对流感流行型别的预测还无法做到很精准。随着将来四价流感疫苗的上市，这一问题可以得到解决。

本次研究显示，目前我省B型流感病毒对NAI的耐药比例维持在很低的水平，我省在临床上使用NAI治疗和预防B型流感病毒是有效的。由于本次研究检测病毒数量较少，难以得出全面结论。我们仍需对流感病毒进行长期、持续的耐药性监测，以便能够及时发现对药物敏感性降低的毒株，为本省流感的防控以及临床用药提供依据。