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无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)是牛乳腺炎(Bovine mastitis)的主要致病菌之一，它不仅会对奶牛的产乳量造成影响，同时可通过“乳腺乳”的传递感染人类，是人兽共患病的典型的致病菌之一[1-4]。近年来由于生态保护政策的不断提升，“禁牧”政策的严格实施，造成乳牛乳房炎的发病机率逐年增多。因此，奶牛乳腺炎的有效防控就显得极为重要[5-8]。但是目前全球尚无有效防治牛乳房炎的疫苗上市，传统的疫苗都存在免疫保护不佳，散毒，潜伏感染等现象[9]。因此，寻找和探索一种安全，有效，多价的非全菌体型基因工程亚单位疫苗是解决奶牛乳腺炎防控难的全球性的科学解决途径[14-15]。 无乳链球菌中致病的因子有很多，除了荚膜，溶血素，链道酶素，链激酶以外，更为重要的是其具有的粘附功能，致病因子是其表向的菌毛，其菌毛有PI-1及PI-2(又称PI-2a，PI-2b)[16-18]。有研究显示，粘膜免疫可以阻止细菌有效定植目标细胞。因此，无乳链球菌的菌毛结构成为了众多学者关注和研究的热点[19]。我们针对无乳链球菌中具有致病性的PI-2a菌毛岛屿的三个亚基基因AP1、AP2、BP进行探究，将与GBS黏附有关的AP1基因、具有菌毛锚定的AP2基因和菌毛骨架蛋白BP基因进行三基因串联，建立表达的载体，从而获得多表位融合的蛋白，通过动物的免疫实验，获得血清，并将血清纯化，并制备多亚单位抗体[20-21]。为后期研制新型基因工程免疫疫苗及快速检测试剂提供可靠的实验基础，同时也为进一步研究牛乳房炎致病菌无乳链球菌的致病机理提供了理论依据。

1 材料与方法

1.1重组质粒构建 AP1-AP2-BP三基因串联重组原核BL21工程菌由内蒙古乳源性致病菌防控工程技术研究中心构建。

1.2主要试剂 在该实验中利用的主要试剂为NaCl、琼脂、NaOH颗粒、卡那霉素、IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)、KCl、NaHPO4、甘油、KH2PO4、考马斯亮蓝R-250、Tris、浓HCl、SDS、过硫酸铵、Acrylamide、BIS、酵母浸粉、Glycine、胰蛋白胨、BPB、异丙醇、醋酸等，均购自哈尔滨博仕生物科技有限公司。

1.3实验动物 3只家兔，由山东中医药大学实验动物室提供。

1.4AP1-AP2-BP克隆基因的表达及样品处理 将AP1-AP2-BP三联基因重组工程菌(pET-30(a+)-AP1-AP2-BP/BL21)用终浓度为1.0 mmol/L的IPTG进行30 ℃恒温诱导表达8～9 h。将诱导完成的培养液分装、离心，并将获得的沉淀用PBS缓冲液以1∶10的比例悬浮，再对其超声破碎20 min左右，将破碎完全的菌液4 ℃离心20 min，取上清并用孔径为0.45 μm的滤膜过滤。

1.5AP1-AP2-BP蛋白粗提取及纯化 选用15%～50%的硫酸铵颗粒对已获得的样品进行粗提取，优化确定其最佳质量浓度，并将其4 ℃离心，将获得的蛋白质沉淀用含有20 mmol/L咪唑的PBS缓冲液进行悬浮，并将混合液放入透析袋中处理24 h。利用亲和层析的方法对获得样品进行纯化，蛋白层析柱的填料选用Ni NTA Beads 6FF，恒流泵的流速保持在4.5，将样品过柱处理。将获得的纯化蛋白AP1-AP2-BP进行SDS-PAGE凝胶电泳及Protein A280测量。

1.6家兔抗AP1-AP2-BP融合抗原的亚单位抗体制备 将饲养的3只家兔进行分组，其中2只家兔为实验组，另1只为对照组。用铝胶水溶性佐剂与纯化后的AP1-AP2-BP蛋白以1∶5的比例混合，采用腹部皮下肌肉多点注射的方式进行免疫，每只家兔免疫抗原含量为0.5 mg/mL，免疫剂量为500 μL/只。每次免疫前采集家兔耳静脉血液约10 mL，每隔7 d进行1次免疫，共免疫4次，从第3次免疫开始，免疫剂量调整为1.0 mL/只。

1.7间接-ELISA检测亚单位抗体滴度 根据检测需求将包被抗原AP1-AP2-BP、待测血清、羊抗兔IgG HRP标记抗体进行倍比稀释，根据检测试剂盒的说明进行操作，并通过全自动酶标检测仪读取检测数据，并进行统计学处理。

1.8AP1-AP2-BP亚单位抗体的纯化 根据天地人和抗体的亲和层析柱说明书配置纯化Buffer，并用层析柱对血清IgG进行纯化，将纯化获得的IgG进行SDS-PAGE凝胶电泳及Protein A280检测。

2 结 果

2.1重组质粒诱导表达结果 将AP1-AP2-BP三基因串联重组工程菌进行IPTG诱导后，对其SDS-PAGE凝胶电泳，通过实验图片的条带对比可以确定AP1-AP2-BP蛋白的分子量大小约为65 kDa，该结果与预测分子质量大小相符，条带清晰，见图1。

1: IPTG诱导前的AP1-AP2-BP三基因串联重组工程菌; 2: IPTG诱导前的AP1-AP2-BP三基因串联重组工程菌破碎沉淀; 3: 低分子质量蛋白Marker(116～18 kDa); 4: IPTG诱导前的AP1-AP2-BP三基因串联重组工程菌破碎上清; 5: IPTG诱导后的AP1-AP2-BP三基因串联重组工程菌; 6: IPTG诱导后的AP1-AP2-BP三基因串联重组工程菌破碎上清; 7: IPTG诱导后的AP1-AP2-BP三基因串联重组工程菌破碎沉淀

2.2IPTG诱导剂浓度的优化结果 通过5组(0.4 mmo1/L，0.6 mmo1/L，0.8 mmo1/L，1.0 mmo1/L，1.2 mmo1/L)不同IPTG终浓度对菌液进行相同条件的8 h培养，经SDS-PAGE凝胶电泳鉴定后可知，伴随着IPTG终浓度的不断提高，其蛋白的表达量有所增强，但持续升高IPTG终浓度并没有显著变化，因此，确定IPTG诱导剂终浓度为1.0 mmo1/L，见图2。

1：低分子量蛋白Marker；2：IPTG诱导前的AP1-AP2-BP三基因串联重组工程菌破碎上清；3-7：分别为0.4～1.2 mmo1/L 5个浓度梯度的IPTG诱导后的AP1-AP2-BP三基因串联重组工程菌破碎上清

2.3诱导温度优化结果 用最佳的IPTG浓度，分别在27 ℃、30 ℃、33 ℃、36 ℃、39 ℃条件下对AP1-AP2-BP菌液诱导8 h，经SDS-PAGE凝胶电泳鉴定结果发现，随着温度的升高，其蛋白的表达量也有所提升，而且在30 ℃的时候，蛋白表达量有显著提高。但再继续升温，蛋白表的达量无明显变化，可判定30 ℃是最佳的诱导温度，见图3。

1：低分子量蛋白Marker；2：IPTG诱导前的AP1-AP2-BP三基因串联重组工程菌破碎上清；3-7：在27 ℃、30 ℃、33 ℃、36 ℃、39 ℃诱导的AP1-AP2-BP三基因串联重组工程菌破碎上清

2.4抗原蛋白盐析处理硫酸铵质量浓度优化结果

通过对硫酸铵的质量浓度设置，将上清液分为8组进行AP1-AP2-BP蛋白的粗提取，经SDS-PAGE电泳可知，在硫酸铵的浓度为20%时，AP1-AP2-BP蛋白的粗提取最理想，该浓度下其杂带最少，见图4。

1：IPTG诱导后三基因串联重组工程菌；2：IPTG诱导后的AP1-AP2-BP三基因串联重组工程菌破碎上清；3-5：15%～25%硫酸铵粗提AP1-AP2-BP重组蛋白；6:低分子量蛋白Marker；7-11:30%～50%硫酸铵粗提AP1-AP2-BP重组蛋白

2.5AP1-AP2-BP重组蛋白悬浮缓冲液的优化结果 通过SDS-PAGE凝胶电泳实验结果表明，利用含20 mmol/L咪唑的PBS溶液做悬浮液处理后的回收率比利用pH值为8.5的Tris-Cl溶液处理后的回收率更高，其效果更为理想，见图5。

1：低分子量蛋白Marker；2：IPTG诱导后的AP1-AP2-BP三基因串联重组工程菌破碎上清；3：含有20 mmol/L咪唑的PBS缓冲液的悬浮液；4：pH值为8.5的Tris-Cl缓冲液的悬浮液

2.6AP1-AP2-BP重组蛋白最优纯化结果 通过对AP1-AP2-BP蛋白纯化过程的优化与改良，经SDS-PAGE电泳分析，纯化的AP1-AP2-BP蛋白质量浓度达到4.353 mg/mL，与优化前直接纯化相比回收率提高了81%，见图6。

1：低分子量蛋白Marker；2：洗涤液洗涤；3-6：洗脱液洗脱

2.7血清中抗体的滴度测定结果 对家兔血清中抗体的滴度进行了ELISA测定，测定结果显示，家兔血清在免疫后抗体的水平逐渐上升，且从第3周开始抗体的水平明显提升，在第4周时抗体滴度达1∶5 600，该结果表明家兔经过免疫所产生的抗体具有很高的滴度水平，见图7。

图7 抗体滴度的检测Fig.7 Detection of antibody titer

2.8抗体的制备 通过亲和层析的方法对血清进行纯化，纯化得到的IgG的浓度非常理想，通过Protein A280的测量，IgG的最高浓度为9.102 mg/mL，表明抗体含量达到要求，符合实验预期，见图8。

1-4：洗脱液洗脱；5-6：洗涤液洗涤；7：纯化的AP1-AP2-BP蛋白；8：低分子量蛋白Marker

3 讨 论

本实验用层析的方法对AP1-AP2-BP重组的蛋白进行了多次相同条件的纯化，经SDS-PAGE电泳可知，在初步纯化过程中在分子量约为33 kDa处出现了明显杂带，效果不是很理想。因此，本实验对重组蛋白的纯化过程进行了系统的优化处理，首先采用硫酸铵沉淀法对重组蛋白进行了粗提取，其次为提高蛋白回收率对粗提蛋白悬浮液的选择进行了比对实验，最后再对回收蛋白进行亲和层析纯化，并将获得的纯化蛋白进行SDS-PAGE电泳处理，且通过Protein A280比对了重组蛋白的回收率。

实验优化前测得AP1-AP2-BP纯化蛋白浓度最高为2.396 mg/mL，浓度最低为1.370 mg/mL。实验优化后测得AP1-AP2-BP纯化蛋白浓度最高为4.353 mg/mL，最低为3.032 mg/mL。且通过SDS-PAGE凝胶电泳图对比分析，不难发现实验优化后的SDS-PAGE凝胶电泳图中分子量约为33 kDa处的杂带明显减少，而且Protein A280测得的重组蛋白的纯化程度也有显著提升。

本实验首次制备兔源牛乳腺炎致病性无乳链球菌PI-2a菌毛岛屿AP1-AP2-BP重组蛋白抗原的亚单位抗体，为下一步制备快速检测牛乳中致病性无乳链球菌奠定了坚实的基础。