徐 进，魏开金，卢建超

(1.中国水产科学研究院长江水产研究所，武汉 430223；2.华中农业大学水产学院，武汉 430070)

克氏原螯虾(Procambarusclarkii)俗称“小龙虾”，是目前中国最重要的淡水养殖虾类。据统计，2017年全国小龙虾养殖面积达8×103hm2，总产量近113万 t，全社会经济总产值约2 685亿元，比2016年增长83.15%[1]。急剧增长的养殖规模背后，随之而来的是日益严重的病害问题[2]。特别是在高温季节，病害问题尤为突出。前期研究显示[3]，30 ℃和35 ℃的高温能引起克氏原螯虾机体发生应激反应，并激活机体的抗氧化系统以降低应激造成的氧化损伤。本实验进一步探讨了高温应激对克氏原螯虾非特异性免疫酶活性的影响，并定量检测了高温应激下白斑综合征病毒(WSSV)在体内的增殖活力以评价高温应激对机体抗WSSV感染的影响，以期为预防克氏原螯虾白斑综合征提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验克氏原螯虾及病毒

试验用健康克氏原螯虾为捕自武汉市梁子湖的野生克氏原螯虾，经过巢式PCR检测[4，5]确定未感染WSSV病毒。试验前于25 ℃暂养1周，挑选活力强、无病无伤、规格基本一致(体重(30±5) g)的克氏原螯虾用于试验。养殖用水为曝气3 d以上的自来水，每日换水一次，暂养期间按虾体重的5%左右投喂商品虾料。人工感染用的病毒悬液为实验室保存的WSSV阳性样本所制备，使用实时荧光定量PCR技术测定其浓度，-80 ℃保存待用。

1.2 高温应激对血淋巴液中免疫酶类的影响

取上述规格基本一致的健康克氏原螯虾，分别由25 ℃直接放入30 ℃和35 ℃的控温水箱中进行高温应激试验。每个温度设置1组平行组，每组50尾克氏原螯虾，控温水箱的规格为70 cm×50 cm×40 cm，高温应激实验持续48 h，实验期间持续充氧，并减少人为干扰，避免额外应激。

每组分别于应激前(0 h)以及应激后3、6、12、24、48 h等时间节点各取3尾虾，将虾迅速捞起并于围心腔抽取0.5 mL血淋巴液。血淋巴液用同等体积的5%肝素钠抗凝，并随后于4 ℃、3 000g离心10 min，留取上清于-80 ℃保存待测。血淋巴液中的总超氧化物歧化酶(T-SOD)、多酚氧化酶(PPO)、溶菌酶(LYZ)、酸性磷酸酶(ACP)均采用检测试剂盒测定，试剂盒为南京建成生物工程研究所产品，碱性磷酸酶(ALP)用希森美康全自动生化分析仪(chemix-800)测定。

1.3 高温应激对WSSV在体内复制的影响

人工感染实验分为3个感染实验组，即35、30和25 ℃组，每组50尾，25 ℃暂养一周后进行人工感染实验。实验前将各组的水温升至相应的温度并持续充氧，保证溶氧不低于5 mg/L。实验虾于腹部肌肉处每尾注射50 μL病毒悬液(含109病毒拷贝)，同时放入相应的试验组内进行饲养，实验期间不投食，不换水。每个实验组分别于感染后3、6、12、24、48、72 h随机取3尾虾，采集鳃组织进行病毒定量检测。WSSV的实时荧光定量PCR检测方法参照文献[6]进行。

1.4 高温应激下人工感染的累积死亡率测定

人工感染实验同上，每个实验组同时设置阴性对照，阴性对照组每尾注射50 μL PBS。持续观察记录克氏原螯虾发病和死亡情况，统计累积死亡率。

1.5 数据统计与分析

数据用SPSS 12.0软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA)和DUNCAN多重比较，所有结果均以平均值±标准差来表示，P<0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 高温应激对克氏原螯虾血淋巴免疫酶类的影响

在30 ℃和35 ℃的高温应激下，随着时间的延长，克氏原螯虾血淋巴液中的T-SOD、PPO、LYZ、ACP和ALP均有不同程度的变化(见表1，图1)。

在30 ℃温度下，克氏原螯虾血淋巴液中的T-SOD在应激后3 h出现上升并维持至12 h，随后开始降低，24 h降低至应激前水平，且继续降低48 h后与应激前差异显著。35 ℃下，T-SOD也在3 h后出现上升，其含量比30 ℃组略高，3 h后出现下降，48 h T-SOD含量比应激前水平略低，但差异不显著。30 ℃温度应激下，PPO的含量在应激后24 h内变化不明显，之后略微升高；35 ℃应激下，PPO含量在0～6 h内略微升高(差异不显著)，之后显著下降，至24 h达到最低点，较应激前差异显著。LYZ含量在30 ℃和35 ℃高温应激后都出现显著下降，24 h后下降速度变缓，35 ℃组比30 ℃组含量更低。35 ℃温度应激后ACP的含量变化不明显。30 ℃应激后ACP含量显著下降，3 h后变化不明显。ALP含量在35 ℃和30 ℃高温应激后先出现下降，3 h(30 ℃)和6 h(35 ℃)后出现回升，但与应激前水平相比变化不显著。总体上看，T-SOD与LYZ含量在高温应激后都出现了显著性降低，PPO、ACP和ALP的变化差异不大。

表1 高温应激对克氏原螯虾血淋巴免疫酶类的影响Tab.1 Effects of high temperature stresses on the immune parameters in the hemolymph of P. clarkii

图1 高温应激后克氏原螯虾血淋巴免疫酶类的变化Fig.1 Varieties of the immune-related enzymes in hemolymph of P. clarkia post high temperature stress

2.2 高温应激下WSSV在克氏原螯虾体内增殖活力

测定了在25、30和35 ℃下WSSV在克氏原螯虾体内的增殖活力。结果显示(如图2)，在35 ℃下，病毒增殖趋势不明显；在30 ℃下，病毒增殖活跃，感染后3 h变化不明显，但在6至24 h出现显著增长，单位组织中的病毒含量增加1 000多倍，随后增长趋势趋缓；同样在25 ℃下，病毒增殖活跃，感染后3 h单位组织中的病毒含量比30 ℃组的略高，但之后一直低于30 ℃组。综上所述，在35 ℃饲养条件下，WSSV在克氏原螯虾体内的增殖受到抑制，但在30 ℃饲养条件下，WSSV在克氏原螯虾体内的增殖较常温(25 ℃)下更活跃。

图2 克氏原螯虾在高温应激下感染WSSV后鳃组织中的病毒载量Fig.2 Viral load in gill tissue of P. clarkia post WSSV infection under high temperature stress

2.3 高温应激下克氏原螯虾对WSSV的抵抗力

测定了克氏原螯虾在25、30和35 ℃下人工感染WSSV的累积死亡率，以评估高温应激下克氏原螯虾对WSSV的抵抗力。结果显示(图3)，25 ℃感染组在感染2 d后累积死亡率剧增，感染3 d后累积死亡率达到90%，感染4 d后全部死亡。30 ℃感染组在感染1 d后累积死亡率剧增，3 d后全部死亡。35 ℃感染组的累积死亡率增加缓慢，感染4 d后死亡率达到20%，5 d后40%，之后没有出现更多死亡。25 ℃阴性对照组未出现发病死亡情况。可见，25 ℃感染组和30 ℃感染组的累积死亡率很高，但30 ℃感染组发病更快，病程更短。

图3 克氏原螯虾在高温应激下感染WSSV后的累积死亡率Fig.3 Cumulative mortality of WSSV infection of P. clarkia under high temperature stress

3 讨论

应激是生物适应性的一种表现形式，但过度的应激往往会引发机体正常生理功能的紊乱，导致各种疾病或亚疾病状况的出现[7]。前期研究结果显示，30 ℃和35 ℃高温能使克氏原螯虾机体产生应激反应，组织中的丙二醛(MDA)含量迅速升高，至24 h后达到最高值[3]。MDA是细胞脂质过氧化的产物，具有很强生物毒性，它可损伤生物膜结构，改变膜的通透性，从而影响一系列生理生化反应的正常进行[8]。本研究探讨了高温应激对克氏原螯虾机体免疫机能的影响。结果显示，在高温应激下，克氏原螯虾血淋巴中的T-SOD与LYZ含量在高温应激后都出现了显著性降低。T-SOD是生物体内具有抗氧化功能的酶，是活性氧自由基的天然消除剂。活性氧自由基(Reactive Oxygen Species，ROS)是吞噬细胞吞噬病原等异物后引发呼吸爆发而产生的超氧阴离子(O2-)、H2O2、OH-及其衍生物等，它具有很强的氧化活性，能攻击周围几乎所有的生物分子，引起蛋白变性、脂类过氧化、DNA突变和酶失活等[9]。有研究表明，免疫细胞对氧化应激非常敏感，因为免疫细胞细胞膜含有高浓度、对过氧化反应高度敏感的不饱和脂肪酸，因此免疫细胞容易受到过量ROS的损伤，进而影响免疫系统功能[10]。因此，过多的ROS若不能及时清除，最终可导致机体的抗病能力下降甚至死亡[11]。高温应激导致克氏原螯虾T-SOD显著下降，必然导致机体的抗氧化能力减弱，使ROS和MDA无法及时清除，对机体的免疫机能产生负面影响。LYZ是一种能水解致病菌中粘多糖的碱性酶，它使细胞壁不溶性粘多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解。LYZ作为非特异性免疫因子，在虾类抗病原微生物感染中具有重要作用[12]。高温应激导致克氏原螯虾血淋巴中LYZ的活性降低，直接导致了其对病原微生物的抵抗力降低。

WSSV是目前危害虾类和蟹类的主要病毒病原[13]，也是克氏原螯虾养殖中危害最大的病毒病原，流行病学资料显示，克氏原螯虾白斑综合征的发病季节一般在3月底至7月[14]，其中5月份是发病高峰期[15]。温度通常能对病毒的复制产生较大影响。Du等[16]研究了高温对WSSV在克氏原螯虾体内复制的影响，其结果显示，克氏原螯虾在(32±1) ℃时未见虾死亡，但转至(24±1) ℃时死亡率达到了100%，组织中的病毒载量从105copies/mg10[14]，表明在(32±1) ℃时WSSV增殖亦受到抑制。这与本研究的结果基本一致，WSSV在35 ℃时，的确组织中的病毒载量显著低于25 ℃和30 ℃组，感染后72 h的数据显示，35 ℃组的病毒载量是25 ℃和30 ℃组的1/1 000左右。30 ℃组和25 ℃组在感染WSSV后组织中的病毒载量持续增加，在感染后3 h，30 ℃组的病毒载量比25 ℃组略低，之后一直高于25 ℃组。推测可能是由于高温应激对免疫系统的胁迫效应导致30 ℃组的病毒增殖更加活跃。而在35 ℃时，温度对病毒增殖的抑制作用更大，尽管免疫系统也受到胁迫，但病毒的复制效率却不高，导致组织中的病毒载量变化不大。病毒增殖活力同样反映在发病进程和累积死亡率上，35 ℃组的发病进程慢且累积死亡率只有35%，而30 ℃组和25 ℃组的发病进程快，分别在感染后的第3天和4天累积死亡率达到100%。可见，高温应激的胁迫效应虽然导致了克氏原螯虾免疫力下降，但同时由于WSSV在35 ℃时复制受到抑制而出现发病率和死亡率降低的情况。这一结论也印证了WSSV的流行病学特征，即在5、6月份时WSSV广泛暴发，而在8月水温最高时却发病较少。

在克氏原螯虾养殖过程中，每年的高温季节无法回避，高温应激导致的免疫胁迫效应必然导致克氏原螯虾对病原的抵抗力降低，使其更容易发病。虽然本实验揭示了在30 ℃和35 ℃下WSSV对克氏原螯虾的致死率有差异，但此规律对于其他病原，特别是细菌病原，并不适用。因此，在疾病高发季节，还是应该采取一切必要手段来降低和缓解高温造成的胁迫效应，来降低疾病的发生风险。