郭 鹤，徐莉佳，叶 勤，陶怡曦，苏 英，吴荣华，3，李 云，3

(1.西南大学动物科技学院，重庆三峡生态渔业产业技术研究院，重庆400715；2.西南大学化学化工学院，重庆，400715；3.西南大学淡水鱼类资源与生殖发育教育部重点实验室，重庆400715)

增殖放流中关键的组成部分是标志与回捕鉴定技术[1]。目前，鱼类标志技术主要有外部、内部、化学、生物和分子标记等主要种类[2-3]。化学标记技术可在短期内标记大量鱼种，并且具有效果显著、成本低、对标记对象伤害较小的优点，故在渔业增殖放流和水产养殖中得到了更广泛的应用和发展[4]。其中，荧光染料技术利用荧光物质可在鱼体的钙化组织(如鳞片、耳石、鳍条等)上沉积以产生荧光标记的特点，已在标记生长率调查、年龄确认和种群与区域鉴定方面的研究中得到了较好的应用[5-8]。目前，盐酸四环素(TCH)、茜素、茜素络合物、钙黄绿素等荧光染料已被广泛应用于鱼类的增殖放流标记，不同鱼类对不同染料的耐受性和敏感性也存在较大差异[9-12]。

TCH因其具有价格低、标记效果显著、标记时间持久等特点，已在国内外使用40余年[13-15]。荧光染料标记法虽效果显著，但高浓度和较长时间的浸泡可能对标记鱼类产生生理胁迫，对机体造成不同程度的损伤进而影响其生长、发育、行为，最终造成死亡[16-17]。而荧光染料标记对鱼类是否会造成生理胁迫和损伤等方面的相关报道甚少，多数研究主要还是侧重荧光染料标记鱼类的效果和持久度。斑马鱼作为一种模式生物，由于其个体小，繁殖发育周期短，胚胎透明易于观察，特别是实验品系具有遗传背景相同，对药物反应具有一致性等特点，被广泛用做毒理实验模型[18]。因此，本研究以斑马鱼为研究对象，考察其对TCH染料的敏感性以及在不同浓度和浸泡时间下的标记效果和抗氧化酶活性的影响，并对TCH标记鱼类进行效果和安全评估。

1 材料与方法

1.1 实验鱼

本实验室自行培养和繁殖的野生AB系斑马鱼稚鱼(平均体长10 mm，25日龄)。养殖水温为28.5 ℃，光周期为14 L∶10 D，每天定时投喂两次且浸泡前后均保持正常投喂和相同光照条件。饲养方法参照《The Zebrafish Book》[19]。

1.2 荧光标记浸泡方法

将TCH试剂(上海生工生物工程公司)与养殖水体按比例混匀，制备成体积为10 L，浓度分别为0(对照组)、100、150、250 mg/L的TCH浸泡液，pH均调至7.0。随后每组中各加入200尾健康的斑马鱼稚鱼，使浸泡密度为20尾/L。

1.3 样品处理

浸泡后的第1、3、6、9、15、30 d，取出各浓度处理组的斑马鱼矢耳石和微耳石，清洗后置于荧光显微镜(Leica DMIL LED)下进行观察和拍照。参照欧阳斌等[20]的研究方法确定耳石的标记效果。同样时间点，随机取各浓度和浸泡时间处理组的12尾稚鱼，按照1∶9的质量体积比，加入配制好并预冷的淡水鱼用生理盐水。在冰上进行匀浆处理后，以4 000 r/min的转速于冷冻离心机(4℃)中离心10 min，取上清液检测。用SOD、CAT、GSH-P x和总蛋白测试盒(南京建成生物工程研究所)测定抗氧化酶活性。

1.4 数据分析

实验结果用回归方法做相关性检验，采用单因素方差分析法(One-Way ANOVA)和最小极差法(LSD)进行分析和比较组间差异平均值，统计结果中P<0.05为显著性差异，P<0.01为极显著性差异。

2 结果与分析

2.1 TCH标记斑马鱼耳石的效果

在绿色激发光N2.1和蓝色激发光I3下观察斑马鱼耳石的标记效果[21]。结果显示，150 mg/L和250 mg/L 的TCH浸泡液对斑马鱼耳石标记率均为100%，TCH对斑马鱼微耳石的标记效果比矢耳石的标记效果明显(表1)。

斑马鱼微耳石的荧光照片显示如图1，(矢耳石的荧光图略)，浓度为0、100、150、250 mg/L TCH浸泡18 h(1-A)和24 h(2-A)，耳石的荧光标记强度与浓度呈正相关。浸泡18 h时，250 mg/L浓度的TCH浸泡液标记斑马鱼耳石的效果最好。浸泡24 h时，150 mg/L和250 mg/L浓度组的标记效果均很明显，标记轮纹在第15 d时就已非常清晰(2-15A)。

表1 TCH浸泡标记斑马鱼耳石的效果Tab.1 Results of otolith marking in Danio rerio with TCH immersion

2.2 TCH标记后斑马鱼的抗氧化酶活性的变化

2.2.1 SOD活性的变化

100 mg/L浓度处理组浸泡18 h的斑马鱼的SOD活性，在浸泡后的第1、3、6、9、15 d均与对照组无显著性差异；150 mg/L处理组的SOD活性在第3 d时显著升高，在第6 d时达到最大值；250 mg/L处理组在第3 d时SOD活性达到最大，在第15 d时恢复到对照组水平。

浸泡时间为24 h，中低浓度组(100 mg/L、150 mg/L)斑马鱼在浸泡后的第1 d，SOD活性有极显著的提高，高浓度组SOD活性在第1 d时显著降低，但在第3 d时显著升高。在随后各时间点的检测中，各浓度处理组SOD活性随时间呈下降趋势，最终在15 d时恢复到对照组水平。结果表明，延长浸泡时间，加快了斑马鱼体内SOD活性的诱导，但高浓度长时间的浸泡可能会短暂抑制其酶活性，对鱼体造成短期内可恢复的氧化损伤。

图1 不同浓度TCH溶液浸泡处理18 h和24 h后1、15、30 d的微耳石荧光标记图Fig.1 Fluorescencephotomicrographs of lapilli at 1， 15， 30 days after immersion for 18 hours and 24 hours in different concentrations of TCH solution

图2 TCH 浸泡处理18 h和24 h后斑马鱼SOD活性的变化(*P<0.05， **P<0.01为与对照组比较检验，下同)Fig.2 Changes of 18 hour and 24 hour immersion treatment of TCH on SOD activity in Danio rerio

2.2.2 CAT活性的变化

100 mg/L和150 mg/L浓度TCH浸泡斑马鱼18 h，对其CAT活性无显著影响；250 mg/L处理组的CAT活性在浸泡后的第3 d显著升高。浸泡时间为24 h时，各浓度处理组在第3 d时的CAT活性均极显著升高。在第9 d时，中低浓度组的CAT活性恢复为对照组水平，而高浓度组的CAT活性显著低于对照组，在15 d时才恢复正常，表现出先诱导后抑制再恢复的趋势。这一结果表明，用250 mg/L浓度TCH浸泡24 h可能对鱼体产生了一定氧化损伤，但并非不可逆的氧化损伤。

图3 TCH 浸泡处理18 h和24 h后斑马鱼CAT活性的变化Fig.3 Changes of 18 hour and 24 hour immersion treatment of TCH on CAT activity in Danio rerio

2.3.3 GSH-Px活性的变化

浸泡处理18 h后，100 mg/L TCH处理组的GSH-Px活性在各个时间点均与对照组无显著差异；150 mg/L和250 mg/L处理组的GSH-Px活性均在第1 d被显著诱导升高，并分别在第6 d和第3 d 时GSH-Px活性达到最大，在第9天时降低，但150 mg/L浓度处理组GSH-Px活性在第9天时仍然为显著升高状态，最终均在第15天时恢复至对照组水平。

浸泡时间延长后，100 mg/L浓度组的GSH-Px活性被诱导，在浸泡后的第3天时显著升高并达到最大值；250 mg/L浓度处理组GSH-Px活性在第1、3、6、9天均被显著诱导升高，诱导持续时间明显延长。在第15天时，各浓度组GSH-Px活性均恢复为对照组水平。结果表明，延长浸泡时间至24 h后，GSH-Px活性出现被诱导现象开始的时间会随浸泡液浓度的升高而提前。

图4 TCH浸泡处理18 h和24 h后斑马鱼GSH-Px活性的变化Fig.4 Changes of 18 hour and 24 hour immersion treatment of TCH on GSH-Px activity in Danio rerio

3 讨论

3.1 TCH标记斑马鱼耳石的效果

荧光染料可实现大量增殖放流鱼种的快速标记，且标记持续时间较长。但同时不能忽视荧光染料的浓度及浸泡时间对鱼类造成的胁迫和生理损伤[21-22]。不可逆的生理损伤和高强度的环境因子胁迫均可增加鱼种的死亡率，从而导致增殖放流效果不理想。本实验结果表明，150 mg/L 和250 mg/L 浓度的TCH对斑马鱼耳石的标记效果明显。综合考虑到成本、标记效率及效果，标记时可采用250 mg/L浓度TCH浸泡18 h或150 mg/L浓度TCH浸泡24 h的方法。以往也有研究表明，四环素标记稀有鮈鲫(Gobiocyprisrarus)、彭泽鲫(Carassiusauratusvar.Pengze)[20]和许氏平鮋(Sebastesschlegelii)[23]的效果较好。因此，推测TCH荧光标记可以应用于其他鱼类的标记，并且可为后续的追踪和调查提供准确的标记信息。

3.2 TCH标记对斑马鱼的抗氧化酶活性的影响

高浓度的抗生素会对水生生物产生毒害作用，TCH作为一种抗生素，必然会在生态安全性方面受到更多关注[24]。章强[25]研究表明，四环素96 h的急性暴露，明显抑制了斑马鱼胚胎的生长发育，并且四环素(10～200 μg/L)导致斑马鱼幼鱼SOD和CAT基因表达量显著上调，体内ROS含量明显上升。活性氧(ROS)主要包含超氧阴离子(·O2-)、过氧化氢(H2O2)和羟自由基(·OH)。当鱼体受环境胁迫因子刺激时会产生氧化应激反应，其体内的抗氧化酶SOD和CAT会催化O2-和H2O2发生歧化反应，防止有害物质·OH的生成，GSH-Px可被H2O2氧化生成H2O，同时将还原性谷胱甘肽(GSSG)变成氧化型谷胱甘肽(GSH)。当机体受到严重胁迫时，抗氧化酶活性被抑制，导致体内大量的ROS无法被及时清除，从而对脂类、蛋白质、核酸等产生不可逆损伤[26-27]。因此，机体的抗氧化酶活性能有效反映出外源因子对机体胁迫和损伤的状况[28-30]。

本研究结果显示，各浓度处理组主要诱导了斑马鱼的抗氧化酶活性提高，出现低浓度诱导，高浓度抑制的现象，但总体上抗氧化酶活性表现为先诱导升高而后随时间延长呈逐渐恢复为对照水平的趋势，这与四环素对纤毛虫(Ciliate)[31]、铜绿微囊藻(Microcysitisaeruginosa)[32]抗氧化酶活性影响的结果相似。吴金明等[33]对茜素红标记中华倒刺鲃(SpinibarbusSinensis)抗氧化酶活性影响的研究中也得到了相似的结果。本实验中，150 mg/L浓度组的抗氧化酶活性被诱导的时间迟于250 mg/L浓度组，并且恢复至正常水平的时间相对于高浓度组滞后，可能由于高浓度的TCH溶液刺激鱼体内SOD和GSH-Px抗氧化酶产生协同作用，快速清除体内多余的氧自由基，缩短酶活性恢复至正常水平的时间。另外，本实验中SOD和GSH-Px活性的诱导呈现出同步性，CAT活性的诱导相对滞后，可能是由于CAT与SOD和GSH-Px的响应模式不同。Livingstone等[34]在沙丁鱼上也观察到SOD与CAT的响应模式不相同的现象。

本研究中，低浓度TCH溶液18 h的浸泡对斑马鱼的抗氧化酶活性无影响，但加长浸泡时间为24 h后，其抗氧化酶活性均被显著诱导升高。250 mg/L组SOD活性在浸泡18 h后第1天没有被显著影响，而在浸泡24 h后，SOD活性在第1天时被显著抑制，在第3天时又被诱导升高；CAT活性在第6天出现极显著升高后，第9天又出现极显著抑制的情况，在第15天时又均恢复至正常水平，且各浓度下延长浸泡时间可使SOD和GSH-Px活性的诱导提前。分析可能由于高浓度及长时间的浸泡刺激使鱼体内其他抗氧化酶或抗氧化系统被激活，平衡了体内过多的氧自由基，从而解除了SOD活性的抑制，使其又恢复到被诱导的状态。

综上，斑马鱼对TCH的敏感性高且标记效果显著，其中150 mg/L和250 mg/L浓度TCH溶液浸泡18 h标记斑马鱼的效果最佳，且没有对鱼体产生氧化损伤。综合考虑TCH适合作为一种性价比较高的荧光染料应用于增殖放流鱼苗的大规模标记工作。