肖 炜，李大宇，邹芝英，祝璟琳，李芳远，佟延南，王德强，杨 弘

(1.中国水产科学研究院淡水渔业研究中心，农业部淡水鱼类遗传育种和养殖生物学重点开放实验室，江苏无锡214081；2.海南省海洋与渔业科学院，海口 570100)

养殖密度是影响鱼类生长速度、养殖产量和效益的主要因素之一。近年来随着水产养殖集约化水平的提高，鱼类等水产动物放养密度不断上升，单位水体的生产量显著提升，经济效益增加明显[1]。然而，水产养殖密度的上升会引起鱼类对资源的竞争加剧，鱼类生理水平发生变化，因此过高的养殖密度可能导致鱼类生长、代谢及免疫水平的变化，致使鱼类用于生长的能量减少，对生产效益产生影响[2，3]。此外，过高的养殖密度也会给养殖水环境带来一定的破坏[4]，因此寻找鱼类合适的养殖密度是目前水产养殖研究的重要方向。

吉富罗非鱼(GIFT，Oreochromisniloticus)是联合国粮农组织向全世界推广养殖的优良品种，具有生长快、食性杂、无肌间刺等诸多优点，深受各国水产养殖业者的欢迎，也是我国的主要养殖鱼类之一。然而随着人工成本 、饲料价格、池塘租金的逐步上升，罗非鱼养殖成本逐年增加，而商品鱼受市场各类因素影响，价格持续下跌，罗非鱼养殖经济效益逐年下降。罗非鱼混养经济价值较高的南美白对虾的模式，可以提高罗非鱼饵料利用率，降低池塘内代谢物积累，而且罗非鱼可以摄食病虾，有效减少对虾病害发生率，提高养殖效益[5]。目前，该混养模式下的罗非鱼最适养殖密度研究还存在空缺，因此有必要对现有的鱼虾混养模式进行优化，进一步提升养殖效益并促进产业可持续发展。本研究对以罗非鱼为主养对象的鱼虾混养模式下不同放养密度罗非鱼的生长、代谢和非特异性免疫指标开展跟踪分析，旨在确定该模式下罗非鱼的最佳养殖密度，为以罗非鱼作为主养对象的鱼虾混养模式提供生产指导。

1 材料与方法

1.1 实验鱼养殖

试验在海口三江湾养殖基地开展，试验池塘为堤铺地膜的对虾养殖池塘，共3口，每口池塘面积3 335 m2，塘深2.0 m，水深1.5 m，塘底有少量淤泥，进排水系统完全，从三江湾入海口取水，水源充沛，水体盐度0.5%，每口池塘配置1台3.0 kW的罗茨增氧机，底部微孔增氧，保持溶解氧在6.0 mg/L以上。5月底分别放养吉富罗非鱼苗(0.65 g/尾)和凡纳滨对虾苗(2.5～3.0 cm)，3口池塘罗非鱼放养密度分别为6 000、8 000、10 000尾/667 m2；对虾苗养殖采用轮捕轮放的方式，每次每口池塘投放5 000尾，共投放3次。试验期间按投放罗非鱼的尾数投喂同等质量的罗非鱼饲料，分别在8∶00～9∶00和17∶00～18∶00利用投饵机进行饲料投喂，饲料投喂量和投喂频率视罗非鱼生长情况、天气、鱼类活动情况进行调整。定期泼洒益生菌改善水质， pH维持在8.0～8.5。

1.2 样品采集及测量

经过150 d养殖后，停止投喂24 h，各池塘随机捕捞罗非鱼100尾，投入100 mg/L的MS-222 中进行麻醉，分别用电子天平和直尺测量体重(BW)和体长(BL)，每个池塘随机选取15 尾鱼，尾静脉采血，4 ℃下5 000g/min离心5 min，吸取上层血清，使用迈瑞BS-600 全自动生化分析仪进行分析测定甘油三脂(TG) 、总胆固醇(TC)、葡萄糖(GLU)、谷丙转氨酶(ALT) 、谷草转氨酶(AST) 、碱性磷酸酶(AKP)、超氧化物歧化酶(SOD)等生理生化指标。同时，每口池取9尾鱼，解剖并取50 mg左右肝脏冻存于液氮中，用于免疫相关基因表达量检测。

按以下公式计算增重率(WGR)、特定生长率(SGR)和肥满度(CF) 。

增重率(WGR)=(Wt-W0)/W0×100%

特定生长率(SGR)= (lnWt-lnW0)/t×100%

肥满度(CF)=100×Wt/L3

其中W0为初始鱼体重(g)，Wt为实验末鱼体重(g)，Lt为实验末鱼体长(cm)，t为养殖天数。

1.3 cDNA的合成与Real-time PCR

肝脏样品在液氮中研磨后，用Trizol法提取总RNA，1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测完整性，并用NanoDrop Lite (Thermo Scientific， USA)分别测定样品总RNA浓度和质量。取1 μg 肝脏RNA使用PrimeScriptTMRT试剂盒(TaKaRa)将mRNA进行逆转录成cDNA。以β-actin为内参基因，设计候选基因C型溶菌酶C-LZM、肿瘤坏死因子TNF-α、细胞白介素IL-1β的引物，所有基因的引物序列见表1。引物序列均由上海生工生物科技有限公司合成。以cDNA为模板，在ABI 7900 HT实时荧光定量PCR仪(ABI， USA)中进行荧光定量PCR。反应体系为20 μL: SYBRGreen Realtime PCR Master Mix(Toyobo)10 μL，目的基因上下游引物各1.6 μL，cDNA模板 1 μL，RNase Free Water 5.8 μL，单样品重复3 次。PCR反应程序为：95 ℃预变性2 min 20 s；95 ℃ 15 s、59～61 ℃ 60 s，循环数为40。

表1 免疫基因的引物序列及其退火温度Tab.1 Immune functional gene primers sequences and annealing temperature

1.4 数据处理与分析

实时荧光定量PCR的数据处理采用2-ΔΔCt法进行计算(ΔΔCt=ΔCt目的基因-ΔCt内参基因)。所有数据分析结果使用 SPSS 19.0统计软件进行单因素方差分析(One-Way ANOVA)， 当结果达到显著差异(P<0.05)时，采用Tukey’s检验进行多重比较，数据用Mean±SD表示。

2 结果与分析

2.1 养殖密度对罗非鱼生长性能的影响

经过150 d养殖后罗非鱼增重率(WG)分别为71 194%、69 285%和49 977%，特定生长率(SGR)分别为4.37%/d、4.36%/d和4.14%/d。池塘的养殖密度对罗非鱼生长有显著性影响，10 000尾/667 m2密度下罗非鱼增重率和特定生长速率显著低于6 000尾/667 m2和8 000尾/667 m2密度下养殖的罗非鱼，此外6 000尾/667 m2密度下的罗非鱼增重率和特定生长速率略高于8 000尾/667 m2密度下的罗非鱼，但两者差异不显著。3个不同养殖密度对罗非鱼肥满度(CF)无显著影响。此外，三个密度下分别收获(10～12.5 g)规格的对虾165、159、151 kg，对虾产量随着罗非鱼养殖密度的上升呈现缓慢下降的趋势。

表2 不同养殖密度对罗非鱼生长性能的影响Tab.2 Growth performance of tilapia reared at different stocking densities

2.2 养殖密度对罗非鱼代谢和免疫的影响

血清葡萄糖、甘油三酯、总胆固醇等代谢指标受养殖密度影响显著，其中10 000尾/667 m2密度下罗非鱼血清中葡萄糖、甘油三脂和总胆固醇浓度均低于6 000尾/667 m2和8 000尾/667 m2密度下养殖的罗非鱼；而谷草转氨酶、谷丙转氨酶含量则呈现相反的趋势，10 000尾/667 m2密度下罗非鱼血清中两者的含量显著高于养殖密度为6 000和8 000尾/667 m2池塘的罗非鱼。血清中碱性磷酸酶和超氧化物歧化酶在3个养殖密度的罗非鱼体中无显著性差异。

表3 不同养殖密度对罗非鱼血清代谢及免疫指标的影响Tab.3 The levels of serum metabolism and immune parameters of tilapia reared at different stocking densities

由图1可知，不同养殖密度对罗非鱼的免疫相关基因表达有显著性影响，其中C-LZM随着养殖密度的上升 显著性下降，10 000尾/667 m2密度下罗非鱼肝脏的C-LZM表达量显著低于养殖密度为6 000 m2和8 000 尾/667 m2池塘的罗非鱼。而IL-1β、TNF-α则与之相反，IL-1β方面，6 000 尾/667 m2密度下罗非鱼肝脏表达水平显著低于8 000和10 000 尾/667 m2养殖密度；TNF-α方面，6 000和8 000尾/667 m2密度下罗非鱼肝脏表达水平显著低于10 000 尾/667 m2。

图1 不同养殖密度对罗非鱼肝脏相关免疫基因的表达水平Fig.1 Hepatic immune functional gene transcripts of tilapia reared at different stocking densities

3 讨论

养殖密度是影响水产养殖生产力和养殖效益的重要因素，而鱼类生长性能是评价养殖密度优劣的重要指标[6，7]。目前对罗非鱼在传统的粗放的养殖管理模式下的最佳养殖密度在1 500～2 500 尾/667 m2之间[8]。而随着现代化养殖设施的应用，我国罗非鱼养殖技术和管理水平不断获得提高，罗非鱼集约化养殖可以突破5 000 尾/667 m2以上的密度。然而由于水体的容量关系该模式下罗非鱼合理养殖密度有一定的上限，不合理的提升养殖密度容易造成拥挤胁迫，进而降低饵料系数和生长速率[9，10]；同时，高密度更易导致鱼类排泄物积累，致使导致养殖水体中氨氮、溶解氧、浮游生物等理化和生物因素产生剧烈变化，对罗非鱼代谢、免疫水平带来负面影响[11]。因此，特定养殖条件和管理条件，均有相对应的适宜养殖密度。研究结果显示密度为6 000、8 000 尾/667 m2罗非鱼生长速率差异不显著，而10 000 尾/667 m2的密度下罗非鱼生长速率显著低于6 000和8 000 尾/667 m2，过低的养殖密度易导致养殖效益下降，该养殖模式下养殖密度上限保持在8 000 尾/667 m2较为合适。

血液作为鱼类重要的组织之一，其生理指标变化与机体的新陈代谢、生理状况有密切关系，因而可用来评价鱼体的健康状况及其对环境的适应[12，13]。强俊等[14]在室内对吉富罗非鱼急性胁迫实验显示随着拥挤胁迫时间的增加，罗非鱼血清GLU和TG水平呈逐渐下降的趋势。在本研究中，养殖罗非鱼的血清葡萄糖(GLU)、甘油三酯(TG)和总胆固醇(TC)均受到养殖密度的影响，随着养殖密度的上升而逐渐下降，这可能归因于罗非鱼在较高密度下的长期胁迫下，维持罗非鱼的健康生长需要更多的能量消耗，GLU作为第一类供能物质，必然处于较低的水平，同时GLU一旦消耗过大必然调动TG和TC类物质开展分解代谢，维持血清中的GLU浓度在合理水平。血清中ALT和AST作为鱼类氨基酸代谢的重要标记酶，在生物体内催化α-氨基酸的α-氨基与α-酮基进行转换，其活性变化可指示鱼类受到胁迫或肝脏应激反应等[15，16]。本研究中罗非鱼在10 000 尾/667 m2密度养殖下ALT和AST的活性均显著高于6 000和8 000 尾/667 m2密度，说明10 000 尾/667 m2高密度养殖下罗非鱼体内的氨基酸代谢处于偏离正常水平的应激状态，通过更多地降解氨基酸来应对环境胁迫，导致ALT和AST的活性上升。

本研究中10 000 尾/667 m2密度下养殖罗非鱼肝脏的C-LZM表达量显著低于养殖密度为6 000～8 000 尾/667 m2的罗非鱼，这可能是因为长期拥挤胁迫下罗非鱼肝脏免疫机能受损，导致C-LZM基因表达显著性下降。而C-LZM是一种参与细胞抵御外界病害侵袭的免疫蛋白，能够抑制体内细菌繁殖，在机体防御过程中起着关键作用[17-19]。同时，肿瘤坏死因子TNF-α和细胞白介素IL-1β属于促炎性细胞因子，在炎症信号级联中，TNF-α通常与下游IL-1β基因表达上调[20]。研究发现10 000 尾/667 m2密度下养殖罗非鱼肝脏IL-1β和TNF-α表达量显著高于6 000 尾/667 m2，这可能是因为过高的养殖密度促进体内IL-1β和TNF-α等促炎性细胞因子表达上调，促使罗非鱼长期处于应激状态。相关研究发现高密度养殖下草鱼[21]、塞内加尔舌鳎[22]等也出现类似的免疫应激变化，与本研究结果相互验证。

综合以上，在当前混养模式下建议罗非鱼养殖密度不高于8 000 尾/667 m2。