杨伟强 万伯顺# 常 庆

上海市嘉定区中心医院外科1(201800) 中心实验室2

背景：胃癌是最常见的恶性肿瘤之一，抑制胃癌细胞增殖是抗癌药物研发的关键。目的：研究獐牙菜苦苷在体内外对MGC803细胞增殖的影响。方法：MGC803细胞予以不同浓度獐牙菜苦苷(0、30、60、90 μg/mL)培养48 h，以MTT法检测细胞活性，Annexin V-FITC/PI法检测细胞凋亡率，ELISA法检测Bax、Bcl-2含量。建立BALB/c裸鼠MGC803移植瘤模型，尾静脉注射不同浓度獐牙菜苦苷(0、40、60、80 mg/kg)，肿瘤体积长至1 000 mm3时处死裸鼠，记录裸鼠开始和最终的体质量，以免疫组化法检测Ki-67蛋白表达。结果：与对照组相比，不同浓度獐牙菜苦苷可有效抑制MGC803细胞增殖，诱导细胞凋亡，Bax含量明显升高，Bcl-2含量明显降低(P<0.05)。在MGC803细胞裸鼠移植瘤模型中，不同浓度獐牙菜苦苷组的肿瘤体积较对照组明显缩小(P<0.05)，Ki-67蛋白表达明显减少(P<0.05)。结论：獐牙菜苦苷是一种安全有效的抗胃癌的植物单体。

消化系统肿瘤是临床上最常见的恶性肿瘤，其中胃癌的发病率较高，发现时往往已处于较晚期，患者的总体预后不良[1]。目前胃癌的治疗以手术切除并配合术后放化疗为主，但目前手术切除并不能保证完全清扫，且主流放化疗药物的疗效欠佳，毒副作用相对较大。异常的凋亡减少是胃癌发生、发展的重要因素之一，寻找新的化合物诱导胃癌细胞凋亡仍是目前临床工作的探索热点[2]。獐牙菜苦苷属于裂环环烯醚萜苷类化合物，广泛存在多种植物中[3-5]。既往药理学研究证实，獐牙菜苦苷(结构式：C16H22O10)具有抗肝纤维化、解痉、消炎、镇痛等多种药理活性作用[6-9]。本研究通过给予胃癌MGC803细胞及其移植瘤小鼠模型不同浓度的獐牙菜苦苷，旨在探讨獐牙菜苦苷对MGC803细胞的体内外抑制作用。

材料与方法

一、细胞株、实验动物、主要试剂

胃癌细胞株MGC803由上海中科院细胞库提供。RPMI1640培养基、胰蛋白酶、胎牛血清购自美国Gibco公司。MTT、二甲基亚砜(DMSO)由美国Sigma-Aldrich公司提供。1%青霉素-链霉素双抗溶液购于碧云天生物技术有限公司。獐牙菜苦苷标准品纯度>98%, 购自于上海诺辰生物技术有限公司。Bcl-2、Bax酶联免疫吸附测定试剂盒购自上海悉墨生物科技有限公司。Ki-67一抗抗体购自美国Abcam公司。

24只雄性BALB/c裸鼠(SPF级)购于上海市肿瘤研究所，约8周龄，体质量(20±1) g，饲养于上海肿瘤研究所动物实验中心，光暗周期12 h∶12 h，自由饮食、饮水。

二、方法

1. 细胞培养：胃癌MGC803细胞置于含10%胎牛血清的RPMI1640培养液中，37 ℃、5% CO2培养。獐牙菜苦苷标准品以DMSO溶解备用，DMSO终浓度不超过0.1%。

2. MTT法检测细胞活性：取对数生长期的MGC803细胞，加入适量胰蛋白酶消化，吹打制成单个细胞悬液，调整细胞密度为5×103/mL，以每孔200 μL接种于96孔培养板上。各孔分别加入不同浓度的獐牙菜苦苷(0、20、40、80、100 μg/mL)，每个浓度设6个复孔。分别培养12、24、48 h后，加入MTT 20 μL/孔，培养4 h。吸除孔内培养基，每孔加入DMSO 150 μL，振荡混匀后，上酶标仪测定570 nm波长处的吸光度(A)值，计算细胞生存率。细胞生存率(%)=用药组A值/对照组A值×100%，采用中效直线回归曲线计算细胞半数抑制浓度(IC50)。

3. Annexin V-FITC/PI法检测细胞凋亡：取胃癌MGC803细胞，制成1×106/mL的细胞悬液，铺设于24孔板，每组设3个复孔，待细胞长至60%～70%密度时，加入不同浓度的獐牙菜苦苷(0、30、60、90 μg/mL)。培养48 h后，胰酶消化细胞，以含血清的完全培养基终止消化，吹打成细胞悬液。具体步骤按照Annexin V-FITC/PI检测试剂盒说明书操作，采用BD-FACS Calibur流式细胞仪检测细胞凋亡率。

4. ELISA法检测Bax、Bcl-2含量：取不同浓度獐牙菜苦苷(0、30、60、90 μg/mL)处理48 h后的MGC803细胞冻融裂解，4 ℃ 4 378×g离心10 min，分离上清液并检测蛋白浓度。参照试剂盒说明书，经包被、加样、加抗体、底物液显色后，酶标仪测定450 nm波长处的各孔A值，根据A值和标准品浓度建立标准曲线，根据标准曲线计算测试样本的Bax和Bcl-2含量并计算Bax/Bcl-2比值。

5. MGC803细胞裸鼠移植瘤模型的建立和分组：取对数生长期MGC803细胞制备成细胞悬液，将200 μL细胞悬液经右侧腹腔皮下注射于BALB/c裸鼠，建立裸鼠移植瘤模型。每三天用游标卡尺测量肿瘤的最长径(a)和最短径(b)，计算瘤体积，瘤体积(mm3)=1/2×a×b2。待瘤体积长至 100 mm3时，随机将裸鼠分为对照组、獐牙菜苦苷组(40、60、80 mg/kg)，每组各6只。将獐牙菜苦苷溶解于5% DMSO/0.9% NaCl溶液中，每日尾静脉注射一次，对照组给予同等剂量5% DMSO/0.9% NaCl溶液。记录裸鼠开始和最终的体质量，平均瘤体积>1 000 mm3时，麻醉下颈椎脱离法处死裸鼠，取出移植瘤并称重。计算抑瘤率，抑瘤率(%)=(1-给药组平均瘤重/对照组平均瘤重)×100%。

6. 免疫组化法检测Ki-67表达：处死裸鼠后，取移植瘤组织，4%甲醛溶液固定，石蜡包埋，5 μm厚连续切片。加入Ki-67抗体(工作浓度1∶200)4 ℃冰箱过夜；加入二抗37 ℃下孵育2 h，DAB显色，光镜下观察。

结果判定：细胞核呈棕黄色颗粒为细胞阳性，计算Ki-67阳性细胞数占所有细胞的比例。

三、统计学分析

结 果

一、体外实验

1. 细胞生存率：MTT实验表明，獐牙菜苦苷的IC50为(56.51±6.20) μg/mL。不同浓度、不同培养时间獐牙菜苦苷对MGC803细胞增殖均存在一定程度的抑制作用(表1)。

2. 细胞凋亡率：Annexin V-FITC/PI法检测结果显示，与0 μg/mL 獐牙菜苦苷组相比，30、60、90 μg/mL 獐牙菜苦苷组MGC803细胞凋亡率均明显上升(19.03%±1.30%、41.78%±5.96%、57.34%±8.43%对6.82%±1.04%,P<0.05)(图1)，且呈剂量依赖性(P<0.05)。

3. Bax、Bcl-2含量：ELISA法检测结果显示，与0 μg/mL獐牙菜苦苷组相比，30、60、90 μg/mL獐牙菜苦苷组促凋亡因子Bax含量明显升高(P<0.01)，而抑制细胞凋亡因子Bcl-2含量明显降低(P<0.01)，Bax/Bcl-2比值升高，且呈剂量依赖性(P<0.05)(表2)。说明獐牙菜苦苷可诱导胃癌MGC803细胞凋亡。

二、体内实验

1. 抑瘤率：与对照组相比，不同浓度獐牙菜苦苷组(40、60、80 mg/kg)裸鼠的瘤重均明显降低(P<0.001)，同时抑瘤率明显升高(表3)。

表1 不同浓度獐牙菜苦苷组的细胞生存率比较

与同时间点0 μg/mL獐牙菜苦苷组比较，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

组别Bax(pg/mL)Bcl-2(pg/mL)Bax/Bcl-2比值0 μg/mL302.48±30.59153.36±21.481.97±0.4630 μg/mL356.17±48.16117.27±19.423.04±0.6060 μg/mL436.81±56.7493.65±13.694.66±0.8990 μg/mL513.69±73.2076.28±14.346.73±1.27

与0 μg/mL獐牙菜苦苷组比较，*P<0.05，**P<0.001

表3 各组MGC803移植瘤重量

*与对照组比较，P<0.001

2. Ki-67表达：免疫组化结果证实，与对照组相比，40、60、80 mg/kg獐牙菜苦苷组Ki-67阳性表达率明显降低(55.14%±5.77%、28.18%±5.73%、10.25%±2.06%对68.27%±8.69%，P<0.05)，且呈剂量依赖性(P<0.05)(图2)。

讨 论

獐牙菜苦苷是一种具有多种药理活性的植物单体，目前研究多集中于代谢紊乱相关疾病的治疗和预防，但尚缺乏其药效分子机制、药代动力学以及毒性方面的研究。在肿瘤研究领域，有学者初步证实了獐牙菜苦苷的体外抗肿瘤活性。赵李剑等[10]的研究显示，50 μg/mL獐牙菜苦苷对肝癌细胞具有抑制、促凋亡作用。李润琴等[11]亦证实，川东獐牙菜提取物可抑制HepG2人肝癌细胞生长并促进其凋亡，獐牙菜苦苷和芒果苷是其主要活性物质。但目前獐牙菜苦苷抑制肿瘤细胞的机制尚未完全清楚。

细胞凋亡是主要的抗肿瘤途径。药物阻滞肿瘤细胞生长往往是通过诱导细胞凋亡来实现的。本实验采用经典的Annexin V-FITC/PI法检测细胞凋亡情况，结果显示不同浓度的獐牙菜苦苷均可诱导胃癌MGC803细胞的早期和晚期凋亡，且呈剂量依赖性，证实獐牙菜苦苷可诱导MGC803细胞凋亡。Bax/Bcl-2比值在细胞生理过程，特别是线粒体生理过程中起有重要作用[12]。Bax/Bcl-2比值升高可导致线粒体膜电位失衡，激活caspase-3等凋亡途径，促进细胞凋亡，从而抑制肿瘤细胞生长[13]，但详细机制有待进一步研究。本研究发现，獐牙菜苦苷可有效升高Bax/Bcl-2比值，从而诱导胃癌MGC803细胞凋亡，抑制细胞增殖。

图1 各组细胞凋亡率的流式细胞图(Annexin V-FITC/PI法)

图2 各组Ki-67的表达情况(免疫组化染色，×200)

进一步的体内实验发现，各组MGC803细胞移植瘤的裸鼠体质量无明显差异，说明獐牙菜苦苷在裸鼠体内是一种安全的药物。同时，不同浓度的獐牙菜苦苷给药后，MGC803移植瘤体积均明显缩小。说明獐牙菜苦苷可有效抑制MGC803胃癌细胞移植瘤的生长。Ki-67蛋白是一种与细胞增殖相关的核抗原，可反映肿瘤细胞的增殖活性[14]。本实验中，随着獐牙菜苦苷给药浓度的增加，Ki-67蛋白水平逐渐下降并呈剂量依赖性，证实獐牙菜苦苷可抑制MGC803移植瘤的增殖。

综上所述，本研究通过体外、体内实验证实獐牙菜苦苷具有明显的抗肿瘤活性，其作用机制可能是通过升高Bax/Bcl-2比值，从而引起肿瘤细胞凋亡并抑制其增殖。獐牙菜苦苷作为一种自然界广泛存在的植物单体，在多种植物中均可稳定获得，为含獐牙菜苦苷的植物的综合利用和药理开发奠定基础，如后期修饰结构、改善疗效，有望成为一种新型的抗肿瘤药物。但其作用机制仍需进一步深入研究。