李妹珍，陈锋烨，冯毅凡，吴 霞

(广东药科大学 中心实验室，广东 广州 510006)

知母(AnemarrhenaeRhizoma) 为百合科植物知母(AnemarrhenaasphodeloidesBge.) 的干燥根茎，味苦，性寒，归肺、胃、肾经。现代药理学研究表明，知母具有清热、抗炎、抗感染、抗肿瘤、抗真菌等多种药理活性[1-2]。知母根茎中含有大量甾体皂苷、双苯吡酮类、黄酮类、木质素类、生物碱类、多糖类、有机酸类及微量元素等[1]。近年来，国内外对知母的活性成分研究逐渐深入，许多从知母根茎中分离出来的成分具有极大的药用价值，如皂苷、双苯吡酮等[3]，但关于知母根茎中微量金属元素的研究却很少。值得注意的是，很多中药材的寒凉温热属性以及药效药性等均与其含有的微量金属元素有关[4-5]。

浊点萃取是近年来新兴的用来分离富集痕量元素的液-液萃取技术，具有操作简单、萃取效率高、富集因子大、不使用有毒有害的有机溶剂等优点，是环境友好型方法。其易于与其他分析技术联用，如紫外可见分光光度法、反相高效液相色谱法、气相色谱法、质谱法及流动注射分析等[6-11]，可实现金属元素及其他样品的分离、富集以及测定等，自问世以来便得到广泛应用。知母根茎中的微量元素铁是人体所必需的十多种微量元素中居于首位的元素，是合成人体血红蛋白的重要原料之一，也是知母清热泻火、生津润燥的基础药效物质之一[12-14]。因此，本文运用浊点萃取-紫外分光光度计法结合湿法消解测定知母中铁元素含量，为其后续研究奠定基础。

1 材料与仪器

1.1 药材与试剂

知母产自河北，购自广州致信药业有限公司，由广东药科大学中药学院刘基柱副教授鉴定为百合科植物知母(AnemarrhenaasphodeloidesBge.) 的干燥根茎。无水乙醇、正丁醇、正己醇、正庚醇、正辛醇(分析纯，天津市致远化学试剂厂)；正癸醇(分析纯，上海阿拉丁试剂)；Triton X-100(分析纯，上海MACKLIN)；硝酸、盐酸、硫酸、30%过氧化氢(广州化学试剂厂)。

1.2 仪器

S220 pH计(瑞士Metter Toledo公司)；GH-252 0.01 mg电子天平(日本AND公司)；Fresco17离心机(美国Thermo公司)；DU-800紫外-可见光光度计(美国Beckman Coulter公司)；DB-3不锈钢电热板(江苏金坛市宏华仪器厂)；DL-400A超声波清洗器(上海之信仪器有限公司)；DFY-500高速中药粉碎机(温岭市林大机械有限公司)；移液枪(德国Eppendorf公司)。

2 方法与结果

2.1 铁标准溶液制备

精密称取0.212 20 g硫酸铁铵，加入10 mL 50%硫酸水溶液，超声5 min。转移至250 mL容量瓶中，用去离子水定容至刻度，摇匀，制成铁离子储备液。精密移取10 mL储备液至100 mL容量瓶中，用去离子水定容至刻度，摇匀，制成铁离子标准溶液。

浊点萃取标准液中的铁元素：准确移取铁标准溶液0.5 mL至15 mL带刻度离心管中，依次加入2.2 mL 0.5 mol/L KSCN溶液，0.6 mL 5% Triton X-100溶液，0.1 mL 5%硫酸溶液，2.2 mL 正己醇。震荡，加入去离子水补足至10 mL，于30℃水浴锅中恒温反应10 min。4 000 rpm下离心5 min，使溶液分相完全，用巴氏吸管小心吸去下层水相，准确加入2.0 mL无水乙醇稀释剩余有机相，混匀。待测。

2.2 供试品溶液制备

2.2.1 湿法消解知母药材 用粉碎机粉碎适量知母药材至细粉末。分别称取3份知母药材粉末样品于锥形瓶中，标记为A、B、C。其中A：1.004 g；B：1.004 g；C：0.998 g。分别加入20 mL浓硝酸过夜预消解，置于电热板上加热至不冒黄烟。取下静置至室温，加入5 mL过氧化氢溶液，继续加热消解。待剩下少量溶液，再分3次补加共约30 mL过氧化氢溶液。加热一段时间后，溶液澄清透明无色，加适量水赶酸，继续加热消解至剩下约1 mL溶液，取下静置至室温，转移至100 mL容量瓶中，用去离子水定容至刻度，摇匀，制成A、B、C三组待萃取样品溶液。

2.2.2 浊点萃取知母消解液中的铁元素 移取1.5 mL A、B、C待萃取样品溶液，余下步骤同“2.1”项下方法得A、B、C供试品溶液。

2.3 标准曲线绘制

分别精确吸取经过浊点萃取处理的铁标准液0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL，相应的铁离子浓度见表1，在波长λ=497 nm下测定吸光度，绘制标准曲线，测定结果见图1。铁离子浓度在1.0～2.8 μg/mL浓度范围内与吸光度呈良好的线性关系，回归方程为：A=0.153 5c-0.017 3，r=0.999 2。

表1 标准曲线待测液浓度

图1 铁离子浓度与吸光度关系的标准曲线

2.4 方法学考察

2.4.1 稳定性实验 取同一份供试品样品，测定铁含量后，分别在1、2、4、8、12、24 h再次测定吸光度。结果见图2。待测样品室温放置1 h后，A、B、C三组吸光度仅下降0.1%～0.7%；而室温放置24 h后A、B两组样品吸光度分别下降8.2%、9.8%，但C组24 h吸光度异常上升，有可能是实验操作问题，数据舍去。由此可推断，样品在配制到测定完成的30 min左右吸光度下降可以忽略，溶剂稳定性强，对结果影响可忽略。

图2 供试品样品不同时间点显色吸光度

2.4.2 铁标准溶液显色稳定性 酸对减缓样品褪色现象有积极作用。本实验分别测定2组用铁标准溶液配制的样品，第1组不加酸，第2组加0.1 mL 5%硫酸，每隔10～15 min测定其吸光度。结果见图3。第2组加酸的样品在40 min时吸光度仅下降2.53%；而第1组不加酸的样品在20 min时吸光度就下降了6.37%，在40 min时下降了13.43%。由此可推测，在绘制标准曲线时加入适量的酸能有效提高溶液的显色稳定性，实验要求在40 min内完成测定，对结果无影响。

图3 铁标准溶液不同时间点显色吸光度

2.4.3 加标回收率测定 按照“2.1”项下方法配制100 mg/L的铁离子标准溶液母液，移取7 mL至100 mL容量瓶中，用去离子水定容至刻度，摇匀，得7 mg/L的铁标准溶液。分别吸取A、B、C三组经浊点萃取的待测样品溶液0.750 mL，以及相当于当量Fe元素的铁标准溶液(7 mg/L)，加入离心管中，以空白消解液为参比，在波长λ=497nm下测定各待测样品溶液的吸光度，每组样品平行测定2份。所得结果见表2。测定6次，样品加标回收率均在95%～105%范围内，加标回收率良好，表明在最佳测定条件下，Fe元素能够充分显色并被萃取出来；RSD值为2.74%，说明此最佳条件下浊点萃取法的重现性良好。

2.5 最佳检测波长的选择

以空白试剂作为参比，在波长400～800 nm范围内对Fe3+-SCN--Triton X-100络合物体系进行光谱扫描，以确定体系最佳吸收波长。结果表明，该体系在497 nm处吸光度最大，因此选择497 nm波长测定该络合物体系。

2.6 紫外分光光度计测定知母消解液中的铁元素含量

取A、B、C三组供试品溶液，分别加入2 mL离心管中，13 000 rpm离心5 min。精确吸取上清液1.5 mL加入离心管中，以空白消解液为参比，在波长λ=497 nm下测定吸光度，结果见表3。由表可知，每1 g知母药材中含有Fe元素170.8 μg，RSD值为3.67%，表明结果准确可靠。

表2 加标回收率实验结果

表3 样品Fe含量测定结果

3 讨论

浊点萃取虽然运用广泛，但其作用原理尚不明确，目前普遍认为是当体系温度时，表面活性剂的胶束尺寸变大，氢键的结合力不足以保持水分子连接在醚的氧原子，随着温度的升高，表面活性剂极性基团水化层被破坏，从而导致胶束内斥力降低和胶束聚集体剧增，溶液出现浑浊和相分离，该温度被称为浊点温度，由于胶束体积小，所以起到了富集作用[6,15]。

在浊点萃取中，浊点温度是影响萃取效率以及溶液体系显色稳定性的最重要的参数之一。影响浊点温度的因素有很多，本文考察了不同种类的醇(正丁醇、正己醇、正庚醇、正辛醇、正癸醇)及用量(1.0～2.4 mL)对浊点萃取效果的影响，结果表明2.2 mL正己醇对1.5 mL知母消解液的萃取效果较好。同时对表面活性剂 Triton X-100(0～2.4 mL)和显色剂KSCN(1.0～2.8 mL)的用量、平衡温度(25～60℃)与平衡时间(0～40 min)、pH(有无加入5%硫酸)进行了考察，确定了浊点萃取的最佳条件，即1.5 mL知母消解液，2.2 mL 0.5 mol/L KSCN作为显色剂；0.6 mL 5% Triton X-100作为表面活性剂；2.2 mL正己醇作为有机相；0.1 mL 5%H2SO4调节pH=1～2以保持体系稳定；体系平衡温度30 ℃，平衡时间10 min。

4 结语

本研究借助湿法消解知母药材，运用浊点萃取法萃取出消解液中的铁元素并采用紫外分光光度法测定其含量。通过实验优化了湿法消解、浊点萃取及紫外分光光度法的最佳条件，测得知母药材中铁元素含量为170.8 μg/g。本实验建立了基于湿法消解知母药材结合浊点萃取-紫外分光光度法，简单、高效、快速地测定知母药材中铁元素含量，对环境无污染，为知母的后续研究奠定了基础。