兰绍阳，谭梅傲，陶双友，蔡佳仲，康锦花，陈 斌△

(广州中医药大学 1第一附属医院脾胃病科， 2第一临床医学院， 3脾胃研究所， 广东 广州 510405)

骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMMSCs)是存在于骨髓中的多潜能干细胞，能分化为软骨细胞和肝细胞等多种细胞。因为BMMSCs免疫原性弱，是异体干细胞移植治疗的理想细胞[1-3]。近几年研究发现BMMSCs具有免疫调节能力，能用于治疗免疫性肝损伤、移植物抗宿主病和风湿免疫疾病[4-5]。BMMSCs发挥免疫调节能力的机制尚不清楚，一些研究都提示，间充质干细胞发挥免疫调节能力需要受到干扰素γ (interferon-γ，IFN-γ)的激活[6-7]，但是另一些研究则未能得出类似结论[8-9]。

RNA干扰(RNA interference，RNAi)是指利用与靶基因同源的双链RNA(double-strand RNA，dsRNA)对靶基因转录后的mRNA分解，从而抑制靶基因表达，该基因在mRNA水平失活而不是删除编码该基因的DNA。与传统的基因敲除方法相比，RNA干扰更容易在高等真核细胞中诱导实现，RNAi技术还可下调单个基因的表达，是研究基因生物学功能的有力工具[10]。短发夹RNA (short hairpin RNA，shRNA)是常用的诱导目的mRNA降解的RNA干扰工具。本实验利用pSicoR-Ef1a-mCh-Puro慢病毒介导shRNA沉默大鼠BMMSCs干扰素γ受体(interferon-γ receptor，IFN-γR)基因，进一步分析沉默间充质干细胞IFN-γR基因表达对其免疫调节能力的影响[11]。

材 料 和 方 法

1 动物及细胞

Wistar雄性大鼠，体重190～220 g，由广州中医药大学动物实验中心提供，许可证号为No.44005800005550；Tran5α感受态细胞购自Transgene；293T细胞株购自ATCC；pSicoR-Ef1a-mCh-Puro购自Invitrogen。

2 主要试剂

LB培养基(生工生物)；T4磷酸化酶、T4连接酶、HpaI和XhoI(NEB)；pLV-gene(表达红色荧光蛋白RFP)、pGag/Pol、pRev、pVSV-G、RPMI-1640培养基、0.25% Trypsin-EDTA(1×)、Lipofectamine 2000 transfection reagent、逆转录和实时定量PCR(real-time PCR)试剂盒(Invitrogen)；Opti-MEM I(1×)和Reduced serum medium(Gibco)；polybrene、植物血凝素(phytohaemagglutinin，PHA)、IFN-γ、MTT、白细胞介素10(interleukin-10, IL-10)及肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α, TNF-α) ELISA试剂盒(Sigma)。……