向运蓉 张 芳 段 静 黄慧敏 何丹妮 刘 媛 陶建平*

(1.三峡库区生态环境教育部重点实验室，重庆 400715； 2.重庆市三峡库区植物生态与资源重点实验室，重庆 400715； 3.西南大学生命科学学院，重庆 400715)

自然界中，植物生长所需的主要资源(土壤、水分、养分、光照、温度等)存在普遍的空间异质性[1]。喀斯特生境中，岩溶侵蚀和土壤形成均是以土壤为媒介的生物地化反应，这一特殊的形成机制使之具有土层浅薄、土被不连续、土壤水分亏缺等特征，加剧了喀斯特的生境异质性[2～3]。此外，空间尺度上，降雨的不均一及土壤持水的不同使得水分异质性成为喀斯特地区植被生长及分布的主要限制因素[4]。异质性生境中，克隆植物能主动搜寻生长所需的资源和有利生境，借助丰富的表型可塑性及生物分配格局的调整，实现“觅食”，并将同化的有机质、糖类等通过克隆器官传输至胁迫分株，使其在异质生境中迅速定居[5～6]。克隆整合可显著增加干旱胁迫下植物的生物量、分株存活率和分枝强度[7]，实现分株间的风险分摊和功能分工，最大限度的利用资源和弱化不利影响，维持和提高植株在异质性水分下的适合度。喀斯特生境中的克隆整合作用一方面有利于植物充分利用贫瘠异质环境中的资源，另一方面也可能对不连续分布土壤有一定改良作用。因此，喀斯特生境中克隆植物的适应性有重要的研究价值。

植物叶片是进化过程中对环境变化最敏感且可塑性较强的器官，叶片气孔是限制水分进出的主要通道。气孔可通过保卫细胞对干旱胁迫及内源信号进行感知，然后做出响应以缓解不利影响[8]。研究表明，随供水量的减少，叶片气孔开度将减小，阻力增加，气孔密度也随之增加，但重度干旱时，气孔密度会下降[9]。此外，水分的丧失还会影响叶片组织结构，减少栅栏组织和海绵组织厚度，栅海比会随着供水量的减少逐渐增加[10]。干旱条件下，植物会表现出一系列的生理变化以适应环境胁迫，但喀斯特地区的克隆植物会以怎样的生物量分配格局及叶片结构应对胁迫还知之甚少。本实验以克隆植物活血丹为材料，对相邻分株施以不同浇水量，模拟喀斯特生境，探究克隆整合对活血丹生物量积累、分配，叶气孔及组织特征的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料

活血丹(Glechomalongituba)为唇形科(Labiatae)多年生克隆草本，野外考察时发现其广泛分布于喀斯特地区。实验所用活血丹幼苗采集于重庆缙云山国家级自然保护区，在西南大学三峡库区生态环境教育部重点实验室的生态园培养备用(E106°24′58″，N29°39′10″)。活血丹每个匍匐茎上连接着两个可进行无性繁殖的分株，每个分株上着生两片对生叶，叶心形或近肾形，上下表面均被有柔毛。

1.2 实验处理

本实验为室内模拟控制实验，开展于生态园大棚内。2017年6月8日于重庆市沙坪坝区海石公园取回喀斯特黄色石灰土，晒干后敲碎成均匀小颗粒状，加入定量水混匀，保持相同容重并装盆。取活血丹苗木并育苗(6月6日)：将一个节间连接的两个分株分别种植于相邻育苗板，培育一个半月后，选取长势相似的克隆分株移栽至花盆中(不区分近端与远端分株，标号为A/B，图1)，保持匍匐茎连接(K)或切断(K0)。按照时间段(9月6日～10月26日)内重庆近30年的平均降雨量(239.9 mm·m-2)和降雨频次(3天一次)确定浇水量，设置4个水分梯度：W1-0%(0 mL/盆)，W2-25%(35 mL/盆)，W3-50%(70 mL/盆)和W4-75%(105 mL/盆)，对A(K-A，K0-A)浇水，B(K-B，K0-B)不浇水，每组6个重复。对所有B株及W1组A株每3天浇10 mL，作为基础供水量以确保材料成活。待匍匐茎连接的两个分株(K-A,K-B)长出分枝后采用交互放置的方式，即新长出的分枝交互放置(A花盆长出的分枝放于B花盆中，B分株同理)，既可消除分株间资源传输方向的干扰，也可增强分株间的整合强度。

1.3 测定方法

处理结束后将B株全部取回(交互放置的分株从两花盆中央垂直位置剪断，取回B花盆上方所有植株)，测定每个分株的匍匐茎长、节间数等。将植株带回实验室，分根、茎、叶三部分， 用信封装好，放入65℃烘箱烘72 h至恒重。用精度0.000 1 g的电子天平称各部分干重，得到生物量积累及分配数据。生物量积累测定指标：根干重、根数量、根平均长、茎干重、总节间数、匍匐茎总长、叶干重、单叶面积、叶片数。生物量分配计算参数：叶分配比(叶质量/分株质量)；茎分配比(茎质量/分株质量)；根分配比(根质量/分株质量)；根冠比(地下干重/地上干重)；比叶面积(叶片单面面积/单面叶干重，在每个分株中选取2～4片完全展开且健康的叶片，用根系分析系统(Epson expression 10000 lx)扫描叶片面积，然后将其装入信封，65℃烘干并称重，计算比叶面积)。

图1 实验处理示意图 K-A，K-B.匍匐茎连接的两个分株；K0-A，K0-B.匍匐茎切断的两个分株Fig.1 Diagram of experimental processing K-A，K-B.Two branches connected by single stone； K0-A，K0-B.Two branches of stolon abscission

另外，每组处理摘取6～8片生长良好的叶放入密封袋中(后期叶总生物量计算时，按照该株成熟叶片的单叶干重×数量，将结果计入叶总干重数据)，置于冷藏箱带回实验室。取出3片立即在下表面涂一层透明指甲油，待其完全风干后，在指甲油上贴一层透明胶带，压紧后，迅速撕下，此时肉眼可见胶带上有一层膜，将其贴于载玻片上，置于显微镜(Nikon Eclipse 80 i)下观察气孔和表皮细胞形态。在目镜(10×)×物镜(20×)倍数下观察气孔数目，记录视野中的气孔数及表皮细胞数；在目镜(10×)×物镜(40×)倍数下观察气孔形态，保存相对清晰的图像，在ipwin 32中进行气孔长度和宽度的测量。将其余未处理的冷藏叶片取出，平放在木板上，取出两块刀片，用手捏紧后垂直于木板、快速且用力地切下，取出两刀片间的叶片条，往载玻片上滴一滴清水后把叶片条置于其中，盖上盖玻片制成装片。调节显微镜，在目镜(10×)×物镜(20×)倍数下观察叶片横截面的海绵组织及栅栏组织，并选取较为清晰的图像进行保存，于ipwin 32中进行海绵组织及栅栏组织宽度的测量。气孔及组织测定及计算参数：

气孔指数=气孔数/(气孔数+表皮细胞数)

(1)

气孔开度=气孔宽度/气孔长度

(2)

栅海比=栅栏组织厚度/海绵组织厚度

(3)

1.4 数据处理

所得数据用SPSS(20.0)软件进行分析，Origin 8.6绘制柱状图，HemI 1.0制作相关性热图。用独立样本t检验(Independentt-test)分析克隆整合与非整合(4个水分梯度下的KB与K0B分别比较)作用下活血丹生物量积累及分配、气孔指数、气孔导度、栅栏组织厚度、海绵组织厚度、栅海比的差异。

2 结果与分析

2.1 克隆整合对生物量积累和分配的影响

2.1.1 克隆整合对生物量积累的影响

克隆整合对活血丹生物量的影响显著(表1)。整合分株(KB)地下根干重、根数量均高于非整合组(K0B)，且分别于W4及W3、W4处理时，达到显著差异水平(P<0.05)，但根平均长在处理间无显著差异。整合作用可增加茎干重、节间数及匍匐茎总长，但均未达到显著水平。W3、W4；W3、W4及W4水分处理时，叶片干重、单叶面积及叶片数量分别表现出KB分株显著高于K0B的趋势，其他水分处理时，同样表现为KB>K0B，但未达到显著差异水平。总而言之，克隆整合有助于活血丹根、茎、叶生物量的积累。

表1 克隆整合对活血丹生物量积累的影响

注：Wi表示水分处理梯度；KB，K0B分别表示克隆整合及非整合B株；不同小写字母表示同一水分处理时，处理间(KB / K0B)生物量在0.05水平(双侧)差异显著。

Note:Wirepresented water gradients; KB,K0B indicated ramets B of clonal integration and non integration,respectively;Different lowercase letters meant significant differences between KB and K0B under the same moisture content(P<0.05).

2.1.2 克隆整合对生物量分配的影响

克隆整合对活血丹根、茎、叶生物量分配的影响不尽相同。W1，W2，W4处理时，根生物量比均表现为KB>K0B，且在W4时达到显著差异水平(P=0.021)(图2a)。相反，茎生物量比于4个水分处理时均表现为K0B>KB，且在W3及W4水分处理时达到极显著差异水平(P<0.01)(图2b)。W1，W2水分处理时，叶生物量比在两处理组中差异不显著，但W3，W4处理下KB叶生物量比极显著高于K0B(图2c)。整体而言，根冠比表现出KB>K0B的趋势，且在W4时达显著差异水平(P=0.023)(图2d)。比叶面积在W2、W3及W4水分处理时，表现为KB>K0B，且在W4达显著水平(P=0.037)(图2e)。综上，克隆整合对活血丹根、叶的影响大于茎。

2.2 克隆整合对叶片气孔及组织特征的影响

2.2.1 克隆整合对活血丹叶片气孔特征的影响

如图3a所示，活血丹气孔导度整体表现为克隆整合组>非整合组，且于W1处理时达显著差异水平(P=0.036)，在W4水分处理时，叶片气孔导度反而表现为K0B>KB。4个水分处理下气孔指数受克隆整合的影响一致(图3b)，均表现为KB

2.2.2 克隆整合对活血丹叶片组织特征的影响

活血丹克隆整合对叶片组织特征的影响结果显示：W2，W3，W4处理时，叶片海绵组织厚度在KB，K0B处理间无显著差异，而W1处理时却表现为K0B>KB(P=0.039)(图4a)。4个水分处理下，叶片栅栏组织受克隆整合的影响各异，其中W1及W4水分处理时，两分株间无显著差异，但W2处理时KB极显著高于K0B(P=0.000)，相反，W3处理时表现为KB显著低于K0B(P=0.015)。栅栏与海绵组织厚度之和整体表现为非克隆整合组>整合组。栅海比表现为KB>K0B，其中W2及W4处理时达到极显著差异水平(P<0.01)，但W3处理时却表现为KB

2.3 活血丹生物量、叶组织及气孔特征的关系

不同水分处理时，克隆整合组(KB)生物量、叶片组织及气孔特征之间的相关性热图(图5)显示：浇水量与栅栏组织、栅海比呈极显著负相关(P<0.01)，与气孔导度显著负相关(P=0.013)，而生物量指标(茎总长、节间数、叶干重、叶片数、根干重、根数量)与浇水量极显著正相关(P<0.01)，与单叶面积显著正相关(P=0.042)。栅栏组织厚度与海绵组织、栅海比存在极显著正相关关系(P<0.01)，与生物量指标均存在负相关关系，其中茎总长、节间数、叶干重、叶片数、根干重达显著相关水平。海绵组织与栅海比存在极显著负相关关系(P=0.000)，与生物量指标负相关，但均未达显著水平。同样，栅海比与生物量之间也存在负相关关系，其中茎总长、节间数、叶干重、根数量达显著水平。整体而言，活血丹茎、叶、根生物量间存在正相关关系，且多数达显著水平。气孔指数与根长显著负相关(P=0.042)。气孔导度与叶片数、根干重、根数量间呈显著负相关(P<0.05)。

图2 克隆整合对生物量分配的影响 不同符号表示相同水分处理下，处理间(KB/K0B)生物量分配的比较，下同。Fig.2 The effects of clonal integration on biomass allocation Different symbols represented the comparison of biomass accumulation between KB and K0B under the same moisture content(ns,P>0.05;*,P<0.05;**,P<0.01),the same as below.

图3 克隆整合对气孔特征的影响Fig.3 The effects of clonal integration on the characteristics of stoma

图4 克隆整合对组织特征的影响Fig.4 The effects of clonal integration on the characteristics of tissue

图5 克隆整合下活血丹生物量、叶组织及气孔特征的相关性热图 WT.水分处理；PT.栅栏组织；ST.海绵组织；P/S.栅海比；SDW.茎干重；TSL.茎总长；TIN.节间数；LDW.叶干重；NL.叶片数；LA.单叶面积；RDW.根干重；ARL.根平均长；NR.根数量；SI.气孔指数；SC.气孔导度Fig.5 Correlation thermal map of along biomass, leaves tissue with stomata of G.longituba with clonal integration WT.Water treatment; PT.Palisade tissue; ST.Spongy tissue; P/S.Palisade/ spongy tissue; SDW.Stem dry weight; TSL.Total stolon length; TIN.Total internode number; LDW.Leaves dry weight; NL.Number of leaves; LA.Single leaf area; RDW.Roots dry weight; ARL.Average root length; NR.Number of roots; SI.Stomatal indices; SC.Stomatal conductance

3 讨论

异质性是生物生境的基本属性，西南喀斯特地区因岩溶侵蚀、岩石裸露，导致土壤斑块性分布，面临着普遍的生境异质性[11～12]，严重影响着植被的群落组成和生物量分配格局。克隆植物在异质性生境中表现出诸多的适应性特点，如表型可塑性、觅食、功能特化、克隆分工等，可缓解局部资源匮乏带来的压力并加速逃避不利生境，是克隆植物在异质性生境中定植、生长的重要策略[13～15]。

克隆植物可将分株的放置格局(分株匍匐茎长度、根长度、叶数量等构件特征参数[16～19])与资源异质性进行精密协调以提高对生境的适合度。本研究中，克隆整合显著增加了干旱生境中活血丹的根、茎、叶生物量，根数量、匍匐茎总长、叶片数也显著增加。这与其他克隆植物(Mikaniamicrantha,Irisjaponica,Bisongrass)在异质性水分处理下的反应是一样的[20～22]。植株地上生物量的增加有助于光能固定，地下根系的延伸可获取更多矿质养分，资源的有效摄取使得克隆植物在异质性生境中迅速定居[23]。此外，活血丹单叶面积、根长度也受克隆整合影响而增加。这表明干旱生境中克隆分株叶面积及根长的整合“修饰”对植物形态可塑性的放大，具有特殊的生态适应意义。

植物的能量分配格局反映了植株在生长过程中对环境的响应规律及能量分配对策，使其对生长、维持、繁殖等功能进行资源权衡[24]。克隆植物在胁迫生境中的能量分配以“觅食”为主[25]。本研究表明，克隆整合可显著增加活血丹根、叶生物量比，增加根冠比和比叶面积。董鸣的研究结果也显示，克隆整合可增加蛇莓的根、叶分配比[26]。对植株根、叶的投资有助于植物的觅食，使得干旱胁迫得到一定缓解。此外，非整合分株的茎生物量比高于整合分株，表明非整合分株在极端环境中可通过茎的延伸觅食资源应对胁迫，茎的生长可以增加独立分株的生存机会，通过分株风险分摊降低基株的死亡风险。何军等的研究同样表明，互花米草在干旱生境中，会通过茎的延伸获取资源[7]。

叶片气孔是CO2进出叶肉细胞及水分蒸腾散失的重要门户，其孔径的大小直接影响着蒸腾作用和光合作用的进行[27]。Kubota等[28]和Wang等[29]的研究表明，干旱胁迫时，气孔呈现出“小而密”的变化趋势，以减少水分的蒸腾散失[28～29]。本研究显示活血丹叶片下表皮气孔导度整体表现为KB>K0B，表明克隆整合的存在对气孔导度的增加可减缓干旱对植株的影响。气孔导度的增加可促进CO2流通，有助于光合作用的进行。但在W4水分处理时，气孔导度反而呈现出非整合分株高于整合分株的趋势，这可能是实验开展时间段为秋季多雨天气，而W4处理时，胁迫分株所需资源由匍匐茎传输供给，所以叶片光合作用减弱，气孔导度降低。气孔指数呈现出K0B>KB的趋势，表明非整合分株在极端环境中以高密度的气孔应对干旱胁迫。

栅栏组织与海绵组织的分化程度可反映环境水分状况[30]。叶肉栅栏组织发达，海绵组织厚度相对减少是植物对水分短缺的响应[31]。本研究中，匍匐茎连接的活血丹分株叶片海绵组织厚度在处理间差异不显著，但栅栏组织厚度、栅海比却呈现出KB

综上所述，克隆整合可显著增加活血丹生物量及根、叶生物量分配比(根生物量比、叶生物量比、根冠比、比叶面积)，降低对茎生物量的分配。克隆整合会增加叶片气孔导度，降低气孔指数。海绵组织受克隆整合影响较小，但栅栏组织及栅海比表现为非整合分株高于整合分株。表明克隆整合可改善植株生物量积累及分配以适应异质性生境，可增加根、叶的生物量投资及调整叶气孔和组织占比以适应干旱胁迫，有助于在水分异质性频发的喀斯特生境中生存和定居，提高植被覆盖率。