崔驰浩 孙 宁 班立桐 黄 亮 史维丽 李春霞 王 玉 杨红澎

承德地区野生木蹄层孔菌的分离鉴定

崔驰浩 孙 宁 班立桐*黄 亮 史维丽 李春霞 王 玉 杨红澎

（天津农学院 农学与资源环境学院，天津 300384）

2016年10月6日在河北省承德市北大山石海森林公园内桦树树干上采集到1株野生真菌，观察该菌的子实体形态特征与菌丝体显微结构，对其 ITS 序列进行扩增、测序，并构建系统发育树，参照相关书籍记载的外观形态，鉴定出该野生真菌隶属担子菌纲（Basidiomycetes），多孔菌目（Polyporales），多孔菌科（Polyporaceae），层孔菌属（），为木蹄层孔菌（）。

木蹄层孔菌；形态鉴定；ITS鉴定

我国真菌资源丰富，有10万余种，具有药效的超过540种。这些真菌大多数为担子菌亚门和子囊菌亚门[1]。木蹄层孔菌（），又名火域层孔菌，属于担子菌纲（Basidiomycetes），多孔菌目（Polyporales），多孔菌科（Polyporaceae），层孔菌属（），是一种白腐菌[2]。木蹄层孔菌是生长于桦树、杨树、梨、苹果等阔叶树干上的一种大型真菌，常在环境阴湿或少光的环境下生长，其子实体为药用部位[3]。

承德蕴藏着丰富的具有较高营养保健及经济价值的野生食用菌资源。目前，只有很少一部分野生真菌得到研究和开发，少数种类局限于简单的采摘和加工，而大多数种类未能得到有效的开发和利用[4]。本文从采集到的疑似野生木蹄层孔菌的形态鉴定入手，对其ITS序列进行扩增、测序，并在基因组数据库中比对分析其亲缘关系，确定该菌株为木蹄层孔菌（）。菌丝体的获得和准确鉴定为进一步开发应用承德野生木蹄层孔菌奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

（1）供试菌株。通过采集的新鲜野生子实体组织分离获得斜面菌丝体，命名为TNCY001，目前该菌种保藏在天津农学院食用菌研发中心。

（2）PDA培养基。马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂20 g，水1 L，pH自然。

（3）引物。采用文献中通用引物：ITS1（5’-TCCTCCGCTTATT-GATATGC-3’），ITS4（5’-GGAAGTAAAAGTCG-TAACAAGG-3’）。

1.2 试验方法

（1）子实体形态特征及菌丝体显微结构观察。观察子实体颜色、纹路及菌管颜色、形态、大小等典型外观形态特征，测量子实体长度、宽度、厚度，拍照；并用刀片将分离纯化的新鲜菌丝体置于载玻片上，乳酸石碳棉兰染色1～2 min，置于100×油镜下观察拍照。

（2）菌丝体DNA提取及凝胶电泳检测。25 ℃下静置培养12 d后，收集菌丝体，使用天津兰瑞生物公司提供的子实体高纯度基因组DNA提取试剂盒，货号为LRC141，进行基因组DNA提取。具体操作按照试剂盒说明书进行，将提取的DNA置于－20 ℃保存备用。取5 μL提取的DNA经1%琼脂糖凝胶电泳检测，用凝胶成像系统进行拍照。

（3）ITS-PCR扩增及序列比对。以基因组DNA为模板，采用真菌通用引物ITS1和ITS4 进行PCR扩增。其扩增体系为：总体系为20 ul体系，其中10×PCR buffer 2uL，dNTP 1.6 uL ，ITS1 1.2 uL，ITS4 1.2 uL，Taq酶0.1 uL，模板1 uL。PCR扩增反应程序为94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，52 ℃下退火30 s，72 ℃延伸1 min，共40个循环。循环结束后在72 ℃延伸5 min，终止温度4 ℃。扩增得到片段，经过琼脂凝胶电泳后在凝胶电泳成像系统中观察，将扩增后的PCR产物送生物工程（天津）有限公司进行测序，测序得到的ITS序列在NCBI 进行核酸序列BLAST比对，找出同源性最大的序列。

（4）系统发育分析。将TNCY001的ITS序列通过BLAST与GenBank数据库进行比对，分别获得与其具有较高同源性的同属不同种的ITS序列；而后通过Clustal X对多序列进行比对；最后采用MEGA5.0软件构建系统发育树，以确定TNCY001的系统发育。

2 结果与分析

2.1 子实体的生态环境及其形态

本试验材料野生真菌为2016年10月6日采集自河北省承德市北大山石海森林公园内桦树树干上，其子实体形态特征如图1。子实体大小6×5（cm），厚4 cm，马蹄形，无柄，色呈棕褐，有厚角质皮壳及环状棱纹，菌肉部位触感较软，边缘钝，菌管锈褐色，厚0.5 cm，软木酸质。初步鉴定为层孔菌属（）物种。

图1 TNCY001的子实体形态

TNCY001菌丝生长浓密，气生菌丝较多，呈放射状向外扩张，菌丝与培养基结合紧密，铺满平板需要10 d，菌种培养时间长于15 d，平皿反面会出现发黄现象（图2）。

图2 TNCY001平板菌落形态

2.2 菌丝体的显微结构

将分离纯化的菌丝体进行显微结构观察，TNCY001 菌丝体为双核细胞，菌丝间横隔短，易明显观察到液泡和细胞核，具有锁状联合，可进行人工驯化栽培（图3）。

图3 TNCY001二级菌丝

2.3 菌丝DNA提取及凝胶电泳检测

对菌丝体进行DNA提取，电泳条带清晰、较明亮，无明显后拖尾现象（图4）。说明基因组DNA完整，可以作为PCR反应的模板。

2.4 ITS-PCR扩增及序列比对

以提取的DNA为模板，ITS1、ITS4 为引物进行扩增，电泳后出现清晰明亮的单一带（图5），显示片段大小为500～700 bp。

图4 TNCY001 DNA 电泳结果

图5 ITS-PCR电泳结果

2.5 TNCY001的系统进化分析

将PCR扩增产物送样进行测序，得到的序列长度为624 bp，序列号在NCBI上注册为MK910113。

分支处的数字为不同菌株间的相似值，菌株名称后面的字母及数字为各菌株在Genbank中的登录号，序列差异在1%水平测定。

将序列放入NCBI中进行BLAST比对，选择同一科已经鉴定出来的ITS片段进行发育树的构建。从图6可以看出，TNCY001与 HM584810.1基因片段相似度高达99%，遗传距离很近。

3 结论与讨论

综合子实体特征和ITS序列的比对结果，参照卯晓岚主编的《中国大型真菌》第473页记载的外观形态，子实体大至巨大，马蹄形，多呈灰、灰褐、浅褐色至黑色，有一层厚的角质皮壳及明显环带和环棱，无柄，边缘钝。从而可鉴定出该野生真菌为担子菌纲（Basidiomycetes）、多孔菌目（Polyporales）、多孔菌科（Polyporaceae）、层孔菌属（）的木蹄层孔菌（）。

图6 基于ITS-PCR序列构建的系统发育分析

传统分类法主要基于形态学特征，其优势是易于观察与比较，需要专业的人士才能正确分类。目前，由于外界环境条件、基因变异、地域分割等原因造成种内形态多样性的现象，使得分类学家对亲缘种的鉴定存在一定的困难。因此，当遇到传统分类方法不能有效区分疑难种时，采用分子生物学技术作为补充显得很有必要。

真菌核糖体rDNA内部转录间隔区（ITS）受外界环境影响较小，进化速度快，表现为种内相对保守、种间差异较为明显[5]。rDNA ITS 序列作为一种遗传分子标记，已被广泛应用于松茸[6]、羊肚菌[7]、灵芝[8]等食药用菌的菌种鉴定。因此，该研究从分子水平上，基于ITS序列对TNCD001进行物种鉴定。依据序列相似性＜95％可鉴别为相同科；95％～99％可鉴别为相同属；＞99％可鉴别为相同种[9]，TNCY001鉴定为。此株承德野生真菌遗传分类地位的解析，对TNCY001的人工驯化栽培和生物活性物质的开发利用具有一定的指导意义。

[1] 戴玉成, 周丽伟, 杨祝良, 等. 中国食用菌名录[J]. 菌物学报, 2010, 2(1): 1-3.

[2] 赵继鼎. 中国真菌志[M]. 北京: 科学出版社, 1998: 124.

[3] 卯晓岚, 蒋长坪, 欧珠次旺. 西藏大型经济真菌[M]. 北京: 北京科学技术出版社, 1993: 464.

[4] 张根伟, 张丽萍, 李书生. 承德坝上松林野生食用菌资源[J]. 中国农学通报, 2012, 28(28): 286-289.

[5] SCHOCHCL, SEIFERT KA, HUHNDORF S, et al. Nuclearribosomal internal transcribed spacer (ITS) region as a universal DNA barcode marker For fungi [J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2012, 109 (16): 6241-6246.

[6] 张微思, 罗孝坤, 张丽英, 等. 松茸菌丝体的纯培养及其鉴定[J]. 中国食用菌, 2010, 29(3): 34-36.

[7] 戴璐, 李峻志, 李安利, 等. 基于ITS序列分析对秦岭冷水沟羊肚菌的鉴定[J]. 中国食用菌, 2010, 29 (6): 45-46.

[8] 王瑞, 何艳华, 管海华, 等. 对4个不同产地松乳菇子实体的分子鉴定[J]. 江苏农业科学, 2010(2): 37-39.

[9] 樊永军, 赵艳玲, 闫伟. 贺兰山两株大型真菌物种分子鉴定与系统地位分析[J]. 广东农业科学, 2014(2): 155-156.

Isolation and identification ofwildfomentarius from Chengde city

Cui Chihao Sun Ning Ban Litong*Huang Liang Shi Weili Li Chunxia Wang Yu Yang Hongpeng

（Tianjin Agricultural College, Tianjin 300384, China）

Wild edible mushrooms were collected on the trunk of birch trees in Shihai Forest Park, Beidashan, Chengde city, Hebei province on Oct. 6, 2016. The morphological characteristics and mycelium growth of wild edible mushrooms bodies were observed. The ITS sequences were amplified, sequenced, and the developmental trees were constructed. According to the appearance offomentarius recorded in the relevant literatures, the wild edible mushrooms was identified as basidiomycetes, Polyporales, Polyporaceae, Fomes, as, The results of this study provide a foundation for the further development of the application value.

; morphological identification; ITS identification

S567.3

B

2095-0934（2019）05-336-04

天津市蔬菜产业技术体系创新团队项目（2017015）；天津市特支计划项目（TJTZJH-QNBJRC-2-12）

崔驰浩（1995—），男，河南驻马店人，硕士研究生，研究方向为作物耕作与栽培学。Tel：（022）23781298；E-mail：842953269@qq.com。

班立桐，E-mail：banlitong@126.com。