杨 颖,胡 家,李 蕾,殷爱红,李慎涛

(首都医科大学中心实验室蛋白质组学研究平台,北京 100069;*通讯作者,E-mail:lishentao@sina.com)

组蛋白的赖氨酸残基存在多种翻译后修饰类型,如乙酰化(acetylation)、巴豆酰化(crotonylation)、甲基化(methylation)、磷酸化(phosphorylation)和泛素化(ubiquitination)等。这些翻译后修饰是细胞进行表观遗传调控的方式之一,通常在包括转录、DNA复制和修复以及染色质动力学等DNA-模板进程中发挥关键的作用[1,2]。这些修饰可以被一些效应蛋白选择性地识别以维持正常的细胞生长和发育,识别过程的失调控通常与发育异常和肿瘤的发生相关联[3,4]。识别过程的调控机制已成为目前表观遗传调控相关领域内的研究热点。YEATS结构域是一类识别组蛋白酰化修饰的阅读器。包含YEATS结构域的蛋白与不同修饰组蛋白的亲和力存在明显差异,从而导致其在细胞内发挥不同的功能[5,6]。近年有关YEATS蛋白功能的研究多由其与不同修饰组蛋白多肽的相互作用为切入点,进而深入探究其作用机制[7]。在这些研究中,等温滴定微量热(ITC)技术是鉴定YEATS蛋白与不同修饰组蛋白多肽相互作用的主要手段[6]。

表面等离子共振(SPR)和ITC技术是近年来检测生物分子间相互作用的主要分析技术。但是,由于组蛋白多肽易与芯片基质发生非特异性的吸附,从而限制了SPR技术在此领域内的应用。本次实验旨在采用Biacore T200分析系统建立高通量筛选和鉴定与特定蛋白相互作用的组蛋白多肽的SPR方法。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 试剂 SA传感芯片、HBS-EP+和PBS缓冲液、surfactant P20、5 mol/L NaCl以及200 mmol/L NaOH购自美国GE Healthcare公司;生物素标记试剂盒EZ-Link NHS-LC-LC-Biotin reagents和BCA蛋白定量试剂盒购自美国Thermo Fisher公司;组蛋白多肽(分子量约2 kD)由北京中科亚光生物科技有限公司合成;YEATS2蛋白(分子量25 kD)和牛血清白蛋白BSA购自美国Sigma公司。

1.1.2 仪器 Biacore T200分子互作分析仪,美国GE Healthcare公司;EnVision多标记读板仪,美国PerkinElmer公司。

1.2 方法

1.2.1 蛋白质在SA芯片表面的固定 用生物素标记试剂盒将蛋白(BSA和YEATS2)生物素化,并采用BCA比色法检测蛋白质的浓度。以HBS-EP缓冲液作为蛋白质固定过程中的运行缓冲液。将SA芯片装入仪器中,芯片表面用1 mol/L NaCl和50 mmol/L NaOH的混合液润洗3次,每次60 s,将蛋白质用PBS缓冲液稀释至50 ng/μl的浓度,以30 μl/min的流速分别注入芯片表面Fc1或Fc2通道,最终达到800 RU左右的固定量。HBS-EP冲洗芯片直至基线稳定。

1.2.2 多肽与芯片表面相互作用的测试 用含0.05% P20的PBS缓冲液(PBS-P)作为运行缓冲液,检测前,用PBS-P高流速冲洗芯片,直至基线稳定。将多肽用PBS-P稀释至250 μmol/L,以30 μl/min的流速分别注入芯片Fc1和Fc2通道60 s,先后分别检测多肽与芯片表面的非特异性结合以及与BSA和YEATS的结合水平。

1.2.3 多肽与蛋白质作用的亲和力分析 将不同多肽用PBS-P分别稀释至3.9,7.8,15.6,31.2,62.4,125,250 μmol/L,采用动力学分析Wizard模板中的动力学和亲和力法进行动力学实验,以30 μl/min的流速进样,结合时间和解离时间均设为60 s,以Fc1作为参比通道,用Biacore T200分析软件拟合所得数据,计算不同多肽与蛋白质的解离平衡常数KD。

2 结果

2.1 BSA对H3K27cr多肽与芯片基质非特异性结合的影响

将250 μmol/L的H3K27cr多肽注入参比通道Fc1和YEATS2反应通道Fc2中,如图1A所示,当Fc1未固定BSA时,Fc1传感曲线迅速上升到200 RU左右,之后缓慢上升,呈时间依赖性,解离过程一开始便迅速下降至基线水平,提示多肽与芯片基质存在非特异性结合;而当Fc1固定等量BSA时,进样后曲线迅速上升至200 RU,之后维持平台期直至进样结束,无上升趋势。图1B显示Fc2响应值扣减Fc1响应值得到的传感图,排除了多肽与运行缓冲液折光率差异的影响,反映多肽与YEATS2蛋白实际结合水平。如图1所示,Fc1未固定BSA时,进样后曲线呈现下降的趋势,Fc1固定BSA后,多肽与YEATS2的结合过程显示为快结合快解离。

A. H3K27cr与参比通道Fc1结合的传感图 B. H3K27与YEATS2结合的传感图图1 BSA阻断H3K27cr多肽与芯片基质的非特异性结合Figure 1 BSA blocked non-specific interaction between H3K27cr peptide and matrix on the chip

2.2 BSA与H3K27多肽相互作用的检测

为了研究BSA与H3K27多肽是否存在相互作用,使用Fc1固定BSA的芯片,将H3K27cr多肽倍比稀释成7个浓度梯度,依次流过芯片表面。传感图和拟合结果显示,多肽流过BSA表面产生的响应值与其浓度呈线性递增关系(见图2),提示BSA与多肽无特异性结合。

A. BSA与不同浓度的H3K27cr结合的传感图 B. 结合的响应值与H3K27cr浓度的关系曲线图2 BSA与H3K27cr多肽无特异性结合Figure 2 H3K27cr did not bind to immobilized BSA

2.3 YEATS2与不同修饰的H3K27多肽相互作用亲和力的检测

为了比较YEATS2与带有不同修饰的H3K27多肽相互作用的亲和力,将H3K27cr、H3K27ac和H3K27多肽分别倍比稀释成不同浓度,依次流过固定了BSA和YEATS2蛋白的芯片,Fc2响应值扣减Fc1响应值所得结果显示,H3K27cr和H3K27ac与YEATS2的结合过程均为快结合快解离,而H3K27与YEATS2无明显结合。随着H3K27cr和H3K27ac浓度升高,与YEATS2相互作用的结合信号也随之增强,与H3K27cr相比,等浓度H3K27ac与YEATS2的结合水平较低,125 μmol/L的H3K27ac与YEATS2的反应响应值比等摩尔浓度的H3K27cr低50%(见图3A)。将数据用分析软件进行拟合处理,计算出多肽与YEATS2相互作用的亲和力常数KD(见图3B)。YEATS2与H3K27cr作用的亲和力最高[KD=(40.83±5.31)μmol/L],其次是H3K27ac[KD=(97.50±6.29)μmol/L],H3K27最低(无法确定KD值)。

3 讨论

采用SPR技术检测蛋白质与多肽的相互作用,通常可以选择3种固定配体的方法:①通过氨基偶联法将蛋白质固定在CM5芯片上;②将生物素标记的多肽固定在SA芯片上;③将生物素标记的蛋白质固定在SA芯片上。在本研究中,我们采用了第3种固定方式,同样是将蛋白固定在芯片上,氨基偶联法所形成的酰胺键的键长约为0.13 nm,可能会导致蛋白质的特异性作用位点失活,而生物素标记后间隔臂的长度为前者的20倍,因此SA捕获法可以充分保留蛋白质的结合活性;但是,组蛋白多肽中赖氨酸和精氨酸等碱性氨基酸含量高,其等电点通常为10-11,而芯片的基质葡聚糖的等电点为3.5,多肽在中性的运行缓冲液中,易与芯片的基质发生非特异性吸附。因此,第2种固定方式是目前检测蛋白质与多肽相互作用的常用方法[8],但与固定生物素化蛋白方法相比,检测通量低,芯片消耗量大,不适用于一个蛋白与3个以上多肽相互作用的筛选和鉴定实验。

在一些研究相互作用的生化实验中,如Western Blot和ELISA,BSA是封闭液的主要成分,用来封闭非特异性结合位点[9]。此外,在免疫共沉淀实验中,无关抗体常被用来作为特异性抗体的阴性对照,以排除非特异性相互作用的可能性[10]。在本研究中,我们将等量的生物素标记的BSA固定在参比通道上,一方面,用来封闭芯片基质上非特异性结合位点,另一方面,代替芯片上的葡聚糖,作为YEATS2的阴性对照蛋白。由结果可见,BSA不仅有效地阻断了H3K27多肽与芯片的非特异性吸附,而且其自身与多肽无明显结合活性。

应用此方法我们检测了3个不同修饰的H3K27多肽与YEATS2蛋白的结合特征,发现YEATS2与H3K27多肽的结合水平和亲和力均为H3K27cr> H3K27ac> H3K27,由此可见,YEATS2蛋白倾向于结合巴豆酰化的H3K27组蛋白,与Zhao等[7]采用ITC技术检测所得结论吻合。就KD数值而言,SPR技术检测的YEATS2与H3K27cr和H3K27ac相互作用的KD分别为40.8 μmol/L和97.5 μmol/L,文献报道ITC技术检测的KD值分别为31.7 μmol/L和226.2 μmol/L[7]。KD数值的差异与采用不同的技术原理和反应体系相关。从时效的角度上比较,本研究方法优于ITC技术,用ITC法检测一对蛋白与多肽的相互作用耗时约1.5 h,切换样品需人工操作;而SPR法可在无人值守的情况下连续自动进行一个蛋白与多至10个多肽相互作用的检测。综上所述,我们首次采用参比通道固定BSA的方法,解决了多肽与芯片非特异性结合的问题,适用于高通量筛选和鉴定与蛋白质相互作用的多肽,可以与ITC技术配合使用。