刘 伟,寇 博

(1西安交通大学医学部第一附属医院血管外科,西安 710061;2西安交通大学医学部第一附属医院耳鼻咽喉头颈外科;*通讯作者,E-mail:492526094@qq.com)

肾细胞癌在人类所有肿瘤中占2%-3%,而在西方国家中是第九大最为常见的恶性肿瘤[1]。过去的20多年里,肾癌的发病率呈2%的增长[2]。尽管新的治疗手段在不断地提高肾癌患者的生存期,但多数患者最终会进展为抵抗型肾细胞癌。因此,探寻有效的诊断性分子标志物以及治疗靶点显得极为重要。

高迁移率族蛋白A2(HMGA2)属于高迁移率族蛋白家族中的一员,是一种非组蛋白染色质蛋白。研究发现HMGA2在正常组织中少有表达,但在喉癌、肺癌等多种肿瘤中呈高表达[3,4]。文献报道,HMGA2可参与肿瘤细胞的增殖、凋亡、分化、上皮间质转化等多种生物学行为[5-7]。而上皮间质转化是肿瘤侵袭转移的特征之一,是多个信号通路参与调控,使上皮细胞特性丧失并获得间充质细胞特性的复杂过程。本研究基于Cancer Browser数据库分析HMGA2在肾癌中的表达及其与上皮间质转化指标的关系,进而为阐明HMGA2在肾癌进程中的作用提供一定的实验依据。

1 材料与方法

1.1 数据库分析

本研究通过检索Cancer Browser数据库,检索“renal cell carcinoma”,提取有关肾癌的临床数据及基因表达(TCGA-KIRC-exp-HiSeqV2-2015-02-24),检索关键词“HMGA2”,提取HMGA2在肾癌中表达的数据,并通过GraphPad 6.0软件分析HMGA2与肾癌的TNM、Stage分期之间的关系。

1.2 临床资料

选取了2019年3月住院的两名肾癌患者,两位患者年龄分别为53岁和58岁,术前检查未合并其他实质脏器肿瘤或感染性疾病,两名患者入院后均行后腹腔镜下肾癌根治术,术后病理检查提示为肾癌。取部分肾癌组织及癌旁正常组织各一块,储存于-80 ℃备用。所有材料的取用均经患者及家属知情同意,并签署相关知情同意书。

1.3 细胞培养和主要试剂

人肾小管上皮细胞HK2、胚胎肾293T细胞、肾癌786-O、769-P、SW839细胞系为西安交通大学第一附属医院转化医学中心实验室所有,1640-DF12培养基、胎牛血清均购自美国Gibco公司,单克隆抗体HMGA2、Twist1、Twist2、Zeb1、Zeb2和β-actin购自美国Abcam公司,TRIzol试剂购自美国Invitrogen公司,PCR引物、RNA反转录试剂盒购自日本Takara公司。

肾小管上皮细胞和肾癌细胞均用含10%胎牛血清的1640-DF12培养基培养,培养基内含青霉素(100 U/ml)及链霉素(100 U/ml),常规在37 ℃、含5% CO2的细胞孵育箱内培养。细胞每隔2-3 d换液、传代。

1.4 Western blot检测EMT相关蛋白及HMGA2蛋白的表达

肿瘤组织或细胞经PBS缓冲液清洗后,用RIPA裂解液裂解组织或细胞。充分裂解离心后提取上清液,并进行蛋白定量。随后取20 μg变性蛋白样品作聚丙烯酰胺凝胶电泳,经转膜和脱脂奶粉封闭后,分别加入HMGA2、Twist1、Twist2、Zeb1、Zeb2、β-actin蛋白一抗(稀释比例均为1 ∶1 000),4 ℃孵育过夜。经TBST液洗脱后,室温下孵育二抗(稀释比例1 ∶1 000)。再次TBST液洗脱后,显影液(美国Bio-Rad公司)显影,利用Image Lab成像软件(美国Bio-Rad公司)进行分析。

1.5 实时定量PCR检测HMGA2的mRNA水平

肿瘤组织或者细胞通过TRIzol法提取总RNA,经RNA定量后利用Takara反转录试剂盒合成cDNA。PCR扩增所需引物自行设计后,由日本Takara公司合成。引物序列为HMGA2正义5′-ACCCAGGGGAAGACCCAAA-3′,反义5′-CCTCTTGGCCGTTTTTCTCCA-3′;β-actin正义5′-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3′,反义5′-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3′。随后进行PCR扩增,通过BioRad CFXManager软件定量分析。

1.6 采用质粒转染敲低靶基因

取两个无酶EP管,分别加入100 μl无血清培养基,然后1个EP管内加入2 μg敲低HMGA2质粒,另1个EP管内加入8 μl X-tremeGENE DNA转染试剂,充分混匀后静置5 min,再将两个EP管内混液混匀后静置15 min,然后将混液加至含293T细胞的6孔板内,将上述293T细胞在细胞孵育箱内培养48 h,随后提取蛋白为后续的Western blot实验做前期准备。

1.7 统计学分析

2 结果

2.1 Cancer Browser数据库分析结果

通过Cancer Browser数据库检索分析,发现随着肾癌的T、N、M分期的逐渐增高,HMGA2的表达亦显著增高,且差异有统计学意义(P<0.01,见图1);随后进一步发现HMGA2的表达与肾癌的Stage分期也呈正相关关系,两者的差异有统计学意义(见图1)。

*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,****P<0.000 1图1 Cancer Browser数据库检索分析HMGA2表达与肾癌的TNM、Stage分期之间的关系Figure 1 Relationship between the expression of HMGA2 and TNM, stage classification of renal cell carcinoma by Cancer Browser database

2.2 HMGA2在肾癌组织及细胞内的表达

Western blot结果显示HMGA2在肾癌组织中的表达显著高于癌旁正常组织,且实时定量PCR显示肾癌组织中HMGA2的mRNA水平亦显著高于癌旁正常组织(见图2)。随后进一步通过Western blot实验发现在多种肾癌细胞内HMGA2的表达显著高于其在正常肾小管上皮细胞HK2内的表达,且实时定量PCR的结果与之一致(见图2)。这说明HMGA2在肾癌中呈高表达。

图2 HMGA2在肾癌组织及细胞内的蛋白和mRNA表达Figure 2 The protein and mRNA levels of HMGA2 in the renal cell carcinoma tissues and cell lines

2.3 HMGA2与EMT指标的相关性

通过Cancer Browser数据库检索分析,我们前期发现HMGA2与Twist1、Twist2呈正相关关系[8]。本研究中分析发现HMGA2与Zeb1、Zeb2的表达之间无明显的相关性(见图3)。通过Western blot实验发现在肾癌患者的肿瘤组织中Twist1、Twist2和HMGA2均呈高表达,而Zeb1和Zeb2的表达无明显变化(见图3)。而相较于正常肾小管上皮细胞HK2,肾癌细胞786-O内Twist1、Twist2和HMGA2均呈高表达,而Zeb1和Zeb2亦无显著改变(见图3)。

图3 HMGA2与上皮间质转化相关指标在肾癌中的相关性Figure 3 Correlations between HMGA2 and EMT-related markers in the renal cell carcinoma

2.4 HMGA2对肾癌细胞内EMT指标的影响

通过Western blot实验发现敲低HMGA2可在肾癌细胞内抑制Twist1和Twist2的蛋白表达(见图4);随后的实时定量PCR结果亦证实HMGA2的敲低可下调Twist1和Twist2的mRNA表达(见图4)。

图4 敲低HMGA2对肾癌细胞786-O内Twist1和Twist2的影响Figure 4 Effect of HMGA2 knockdown on Twist1 and Twist2 of human renal cell carcinoma 786-O cells

3 讨论

HMGA2作为一种转录因子,其自身不具备转录活性,但其包含有3个AT-hook结构,能够结合于DNA上的AT序列富集区域,进而调控相关靶基因的表达。HMGA2在成人的正常组织中少有表达,而在肿瘤组织中呈高表达,且影响肿瘤的进展。研究发现HMGA2可促进乳腺癌的恶性进程[9]。也有文献报道,HMGA2在神经胶质瘤中可促进其侵袭及不良预后[10]。这说明HMGA2在肿瘤中扮演着促癌基因的角色。本研究通过Cancer Browser数据库发现HMGA2的表达与肾癌的TNM分期、Stage分期呈正相关关系,且两者的差异有统计学意义。这提示HMGA2在肾癌的进程中起着重要作用。

而研究显示,在肾癌ACHN细胞内,HMGA2的敲低可抑制其增殖和侵袭能力[11]。且Na等[12]学者发现HMGA2的高表达常常提示肾透明细胞癌的不良预后。为了进一步明确HMGA2在肾癌中的表达,通过Western blot和实时定量PCR发现HMGA2在肾癌组织及细胞内的表达显著高于癌旁正常组织及正常肾小管上皮细胞。这提示HMGA2在肾癌中可能是一个促癌基因。而新近研究报道HMGA2与肿瘤的侵袭迁移、上皮间质转化有着紧密关联[13]。Sun等[14]学者发现HMGA2可通过调控Twist1促进胃癌的侵袭进程。也有学者发现沉默HMGA2可抑制前列腺癌的侵袭迁移能力[15]。而新近研究报道HMGA2可以通过调控TGF-β/Smad2信号通路促进肾癌细胞的上皮间质转化过程[15]。本研究则通过Western blot实验发现不管在肾癌组织还是在肾癌细胞内,HMGA2与Twist1、Twist2均呈高表达,而Zeb1和Zeb2的表达无明显变化。这说明HMGA2与肾癌的侵袭转移尤其是上皮间质转化指标Twist1、Twist2关系密切。随后我们进一步通过敲低HMGA2发现肾癌细胞内Twist1和Twist2的表达水平明显下调。这提示HMGA2可在肾癌细胞内正向调控Twist1和Twist2的表达。研究发现在胃癌细胞内HMGA2可通过靶向作用于Twist1进而调控上皮间质转化过程,因此HMGA2在肾癌细胞中如何调控Twist1和Twist2是后续研究的重点[7]。

总而言之,基于Cancer Browser数据库发现HMGA2与肾癌的TNM分期、Stage分期呈正相关。而通过一系列细胞生化实验发现,HMGA2在肾癌组织及细胞内呈高表达,且HMGA2可正向调控Twist1和Twist2的表达。