王贵佐,陈芬芬,张叶钦,苗 毅,刘 璐,尚文丽*

(1陕西省人民医院呼吸与危重症医学科,西安 710068;2西安交通大学第二附属医院干部保健办公室;*通讯作者,E-mail:zaixuyuan1115@126.com)

急性肺损伤(acute lung injury,ALI)/急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)是心源性以外的各种肺内、外致病因素导致的急性、进行性呼吸衰竭。据统计美国每年ALI/ARDS的发病率高达75/100 000,死亡率接近30%。并且随着人口的老龄化加重,急性肺损伤的发病率将会不断增加[1]。目前有糖皮质激素、细胞因子疗法等多种治疗措施,但疗效较差,迫切需要发现新的治疗靶点及开发新的治疗药物。

氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferators activated receptor,PPARγ)是核激素受体家族中的配体激活受体,其配体包括罗格列酮、吡格列酮等,PPAR-γ与配体结合激活后,与视黄醇类X受体(RXR)形成异二聚体,进而进入细胞核内与靶基因启动子上游的PPAR反应元件结合,最终调控靶基因的转录,从而发挥抗炎及抗氧化作用[2]。多个体外研究发现配体通过激活PPARγ可抑制肺泡上皮细胞、中性粒细胞、巨噬细胞、淋巴细胞分泌和释放TNF-α等细胞因子,减轻炎症因子的趋化作用,并促进炎症细胞的凋亡,减轻肺正常细胞损伤,增加表面活性物质相关蛋白的表达,从而从多方面对急性肺损伤起保护作用[3-5]。进一步研究发现激活PPARγ可抑制炎症及氧化应激反应,对LPS诱导小鼠急性肺损伤发挥保护作用[6,7]。上述研究提示激活PPARγ具有治疗急性肺损伤的潜在价值,然而具体机制尚待进一步研究。

血红素加氧酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)是血红素加氧酶的应激诱导型,在保护肺组织免受炎症和氧化剂诱导的细胞及组织损伤方面发挥重要作用。在包括Ⅱ型肺泡上皮细胞,肺泡巨噬细胞在内的多种细胞内,血红素、低氧、高氧、NO、内毒素和IL-6、TNF-α等促炎性细胞因子均可诱导HO-1表达[8]。HO-1基因敲除小鼠抗氧化应激的能力减弱[9]。而Lee等[10]研究发现在人肺泡上皮细胞内过表达HO-1,对高氧的耐受性增强,而应用HO-1的抑制剂锡原卟啉(tin protoporphyrin,SnPP),上述保护作用消失。提示上调HO-1的表达可能对急性肺损伤发挥保护作用。研究显示激活PPARγ在心血管细胞中可显著上调HO-1的表达,发挥保护作用[11,12]。然而罗格列酮是否能上调HO-1蛋白的表达,在肺部疾病中发挥保护作用尚待研究。

本研究应用脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的急性肺损伤动物模型,评估罗格列酮激活PPARγ对LPS诱发肺部炎症的保护作用,并进一步探索HO-1是否介导激活PPARγ对LPS诱导急性肺损伤的保护作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物与主要试剂

6-8周雄性BALB/c小鼠,SPF级,体质量22-25 g,由陕西省人民医院实验中心提供,动物生产许可证SYXK(陕)2016-006。罗格列酮片(文迪雅,出厂批号10045192,国药准字H20020475)生产公司为葛兰素史克有限公司。脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)来源于大肠杆菌055:B5,购于Sigma-Aldrich。兔抗鼠HO-1一抗购于美国Cell signaling technology;HRP偶联的羊抗兔二抗由美国Sigma-Aldrich提供。IL-6检测试剂盒为R&D Systems ELISA试剂盒。RIPA裂解液由武汉博士德生物工程有限公司提供。

1.2 模型制作和实验分组

6-8周龄BALB/c雄性小鼠15只随机分3组：①对照组(Con组)，气管内滴注PBS 60 μl，作用24 h；②LPS模型组(LPS组),气管内滴注1 mg/ml LPS 60 μl，作用24 h；③罗格列酮治疗组(Rosi+LPS组)，分别于滴注LPS前24 h和0.5 h灌胃给予罗格列酮(20 mg/kg)预处理，再气管内滴注1 mg/ml LPS 60 μl造模24 h。

1.3 收集支气管肺泡灌洗液(BALF)及肺组织样本

气道内滴注LPS作用24 h后,用10%水合氯醛1 ml/100 g腹腔注射处死小鼠,用4 ℃预冷的无菌PBS 0.6 ml进行支气管肺泡灌洗,重复灌洗3次,BALF的回收率达80%。BALF离心10 min(4 ℃,1 000g)。分别收集上清和沉淀,上清液在-80 ℃保存备用。BALF中沉淀用无菌PBS重悬,利用细胞计数板进行细胞计数。取细胞沉淀涂片,晾干后进行瑞氏染色,计数中性粒细胞。支气管肺泡灌洗后分离右肺组织并在-80 ℃保存。

1.4 肺组织病理学检查

取出分离后的左肺组织利用10%中性缓冲甲醛液固定,固定后对左肺组织进行脱水,透明,石蜡包埋后切片(厚度为5 μm),苏木精-伊红(HE)染色,观察肺组织病理学改变。

1.5 支气管肺泡灌洗液中IL-6浓度检测

支气管肺泡灌洗液上清中IL-6的浓度利用ELISA方法检测,所有操作均严格按照试剂盒说明书进行。

1.6 免疫印迹法检测血红素加氧酶-1表达

精密称取各组小鼠肺组织,根据RIPA裂解液使用说明书制备肺组织匀浆,肺组织与RIPA裂解液的比例为1 mg ∶7.5 μl,用玻璃匀浆器上下、旋转充分碾磨。在冰上裂解1 h,14 000g离心20 min,取上清,利用Western blot检测各组小鼠肺组织血红素加氧酶(heme oxygenase,HO-1)(1 ∶500)表达的变化,应用GAPDH(1 ∶5 000)作为内参校正。

1.7 统计学分析

2 结果

2.1 激活PPARγ对肺组织病理改变的影响

与对照组相比,气道内滴注LPS的小鼠肺组织病理显示,肺泡及肺间质大量出血,组织水肿,炎症细胞大量浸润,肺泡间隔增厚,正常的肺组织结构明显被破坏。而应用罗格列酮预处理(在LPS给药前24和0.5 h)小鼠后上述改变被明显抑制(见图1)。

A.Con组 B.LPS组 C.Rosi+LPS组图1 激活PPARγ对LPS诱导小鼠急性肺损伤病理改变的影响 (HE染色,×200)Figure 1 Effect of activation of PPARγ on pathological changes of LPS-induced acute lung injury in mice (HE,×200)

2.2 激活PPARγ对小鼠肺组织浸润炎症细胞数及BALF中IL-6的影响

气道内滴注LPS 24 h后,与对照组相比,BALF内炎症细胞数、中性粒细胞计数、BALF中IL-6的浓度均显著升高(P<0.01,见图2)。而应用罗格列酮预处理后,可显著减轻LPS诱导小鼠急性肺损伤动物模型内肺组织浸润的炎症细胞数及BALF中IL-6浓度(P<0.01,见图2)。提示激活PPARγ可抑制LPS诱导小鼠急性肺损伤动物模型炎症反应。

与对照组比较,**P<0.01;与LPS模型组比较,##P<0.01图2 激活PPARγ对小鼠肺组织浸润炎症细胞数及BALF中IL-6的影响 (n=3)Figure 2 Effect of activation of PPARγ on the inflammatory cell numbers and the concentration of IL-6 in BALF of mice (n=3)

2.3 激活PPARγ对小鼠肺组织血红素加氧酶-1表达的影响

本实验中,给予罗格列酮灌胃预处理,再气管内滴注LPS作用24 h。应用Western blot法检测小鼠肺组织内HO-1及GAPDH的表达,应用GAPDH内参校正后,对照组小鼠肺组织内的HO-1蛋白表达较弱,LPS模型组小鼠肺组织内HO-1蛋白表达较对照组有所升高,然而应用罗格列酮预处理小鼠肺组织内HO-1蛋白表达较LPS模型组小鼠显著增加(P<0.01,见图3),提示HO-1为PPARγ的靶基因,罗格列酮通过激活PPARγ可上调HO-1蛋白的表达。

3 讨论

罗格列酮是一种高选择性、强效的PPARγ激动剂,它激活PPARγ核受体后,可以通过促进葡萄糖合成、转运及胰岛素增敏的相关基因发挥其作用,同时激活脂肪酸代谢的基因来参与脂肪酸的调节,以罗格列酮为代表的噻唑烷二酮类药物具有增加胰岛素敏感性的作用,在临床上被用于2型糖尿病的治疗。

已有研究表明,配体激活PPARγ能显著减轻急性肺损伤动物模型肺水肿、抑制TNF-α等炎性细胞因子表达,这种保护作用可能与抑制HMGB1/RAGE炎性信号通路有关[13]。配体激活PPARγ对LPS诱导的急性肺损伤发挥保护作用,这可能与抑制NF-κB信号通路有关[14]。上述研究表明,PPARγ可能是ALI/ARDS治疗的潜在作用靶点。本研究同样提示罗格列酮激活PPARγ对LPS诱导急性肺损伤发挥保护作用,同时对这种保护作用的可能机制进行了进一步研究。

与LPS组比较,#P<0.01图3 激活PPARγ对HO-1蛋白表达的影响 (n=3)Figure 3 Effect of activation of PPARγ on the expression of HO-1 in lung tissue (n=3)

对动物模型研究发现上调HO-1的表达可对急性肺损伤[15]、肺动脉高压[16]等多种疾病发挥保护作用。对心血管系统的研究发现激活PPARγ可上调HO-1,减轻炎症反应和氧化应激,对其发挥保护作用[11,12]。因此激活PPARγ能否通过上调HO-1表达对急性肺损伤的保护作用值得进一步探讨。本研究中,给予罗格列酮灌胃预处理,与LPS诱导的急性肺损伤小鼠模型比较,罗格列酮预处理显著减少以中性粒细胞为主的炎症细胞在肺组织内的浸润,抑制了IL-6的分泌。同时Western blot显示HO-1的表达明显增加,这提示罗格列酮激活PPARγ对急性肺损伤的保护作用,可能与HO-1上调有关。

本研究证明了罗格列酮通过激活PPARγ对LPS诱导ALI/ARDS发挥保护作用,激活PPARγ对LPS诱导ALI/ARDS的保护作用可能与HO-1的上调有关。上述研究结果提示PPARγ激动剂具有治疗急性肺损伤的潜在价值,并为其治疗提供新的实验依据。