李洪亮，刘 明，汪选斌＊＊

（1. 湖北医药学院 附属人民医院肿瘤中心中药药理实验室 441000；2. 生物医药研究院 武当特色中药研究湖北省重点实验室 湖北 十堰 442000；3. 西安交通大学药学院 西安 710061）

恶性肿瘤是世界性难治性慢性病[1]。具有死亡率高、复发率高、易转移等特点，目前的手术切除、化疗、放疗，乃至免疫疗法等仍无法使其彻底治愈。从中药药理学规范研究的角度，针对肿瘤生物学特征（hallmark）靶点的研究可以较好地总结、归纳抗肿瘤的药理机制[2]。脂代谢异常是hallmark 其中之一。由于肿瘤细胞快速增殖，为保证能量供应，在肿瘤组织中对脂质合成、去饱和化和转运会增加[3]，并通过相关的通路对肿瘤的增殖和死亡[4]、血管生成、侵袭、迁移造成影响[5]。近年来中药抗肿瘤脂代谢受到关注。

蓼科植物何首乌（Polygonum multiflorum Thunb.）是常见的补益类中药[6]，也是道教医药中常用的补益方药[7]，东汉时期被称为马肝石，以干燥块根入药。唐朝李翱在《何首乌传》中记载了有位叫何首乌的人，祖上信奉道教，“生而阉弱，年五十八，无妻子，常慕道术，随师在山”，偶然得药用之，不仅所有疾病皆无，头发还变黑，祖孙寿命皆过百，后人便以其孙之名把这种藤能“夜交”的药称为何首乌[8]。《中国药典》中记载何首乌（Polygoni Multiflori Radix）有解毒、消痈、截疟、润肠通便之功效，制首乌（Polygoni Multiflori Radix Praeparata.）可补肝肾、益精血、乌须发、强筋骨、化浊降脂[9]。现代药理学研究发现何首乌、制首乌主要药理作用近似，可用于神经保护、抗衰老、心肌保护、降血脂及抗动脉粥样硬化、保肝致泻、抗菌、促进造血功能，以及具有抗肿瘤作用[10]。临床组方可用于肝癌、脑瘤、甲状腺癌、白血病[6,11]。本文试结合本课题组近年来建立的基于肿瘤生物学特征的抗肿瘤中药药理学筛选技术平台，对何首乌抗肿瘤脂代谢进行回顾，为进一步开发何首乌的抗癌活性和临床应用提供参考。

1 基于肿瘤生物学特征的抗肿瘤中药药理学筛选技术平台建设与何首乌抗肿瘤细胞能量代谢失衡

肿瘤发病机制差异很大，即使同一器官的肿瘤，如肺癌中有小细胞肺癌和非小细胞肺癌，后者又包括鳞癌、腺癌、大细胞癌[12-13]；乳腺癌按分子分型，可分为：Luminal A 型、Luminal B 型、HER-2+型和Basal-like型[14]。其诊治完全各异。提示针对其特定的分子靶点开展研究，是中药药理学规范研究要点。因此，基于Hanahan在Cell上肿瘤生物学特征的经典分类[15]，我们将中药抗肿瘤学药理学研究根据分子靶点机制分为了11 类，并逐步建立相应的规范研究技术平台[2,16-21]。我们总结发现，何首乌可抑制肿瘤细胞增殖、组滞细胞周期、诱导凋亡、抗肿瘤细胞转移、抗血管新生[22]、调节免疫、抑制肿瘤干细胞[6,23]。但这些作用是否之间存在相互作用或干扰（cross-talk）尚不清楚。

肿瘤的细胞能量代谢失衡（deregulating cellular energetics）是肿瘤生物学特征之一，包括糖代谢异常和脂肪代谢异常[15]。肿瘤细胞的糖代谢异常主要是对糖的摄取[24]和有氧糖酵解（Warburg 效应）[25]。有文献报道何首乌中有效成分二苯乙烯苷对肝脏糖代谢有影响，可减轻糖尿病模型大鼠和小鼠肾损伤（包括对30 mmol/L 高糖环境足细胞的氧化损伤）[26-28]，改善胃肠动力[29]，目前没有二苯乙烯苷对肿瘤细胞糖代谢的影响报道。另一方面，我们总结发现，何首乌能够减轻非酒精性脂肪肝、抗肝氧化、肝纤维化、肝硬化和肝癌，可用于高脂血症[30]。并且大黄素、大黄酚（何首乌中含有的蒽醌类成分）对肿瘤脂代谢可能有作用[31-32]，但机制尚不清楚，这些引起了我们的兴趣。

2 何首乌抗肿瘤脂代谢的机制

肿瘤的新生脂肪（de novo lipogenesis）与肝癌脂代谢中的重要转录因子固醇调节元件结合蛋白1（sterol regulatory element-binding protein 1，SREBP1）关系密切，SREBP1 在多种肿瘤中高表达，并通过影响下游的脂肪酸代谢相关因子参与了肿瘤的脂肪代谢。如通过乙酰辅酶A 羧化酶（acetyl CoA carboxylase，ACACA）、脂肪酸合成酶（fatty acid synthetase，FASN）、ATP-柠檬酸裂解酶（ATP-citrate lyase，ACLY）等，促进脂肪酸（fatty acids，FA）与甘油三酯（tryglyceride，TG）的合成；通过促进硬脂酰CoA 去饱和酶1（stearyl coenzyme A dehydrogenase-1，SCD1）的转录，使脂肪酸去饱和化；通过影响下游脂肪酸转运蛋白（fatty acid-binding protein3/7，FABP3/7），影响FA 的转运[33]。何首乌是否干预了肿瘤的脂代谢，是否与上述途径有关是我们需要研究的方向。由于制何首乌具有补肝肾之功效，结合前期工作，我们选用制何首乌醇提物作用于肝癌细胞来研究其抗癌活性。通过研究发现，制何首乌醇提物可抑制肝癌细胞的增殖，并使肝癌细胞线粒体膜电位下降，从而诱导了肝癌细胞内源性凋亡。进一步又发现制何首乌醇提物干扰了肝癌细胞的FA 去饱和化，使肝癌细胞的不饱和酸亚油酸和棕榈油酸与其对应的饱和脂肪酸硬脂酸和棕榈酸比例下调，提示制何首乌醇提物干扰肝癌细胞FA 的去饱和化与其诱导细胞凋亡可能有关；FA的去饱和化依赖于SCD1的活性，其上游正是SREBP1。于是我们有检测了制何首乌醇提物对肝癌细胞SREBP1 和SCD1 的影响，发现二者RNA 和蛋白表达水平均下降，与我们的推测一致，即：SREBP1 可介导下游多种脂代谢信号的转录，其中包括SCD1[34]，SCD1 是一种锚定在内质网的酶，可催化饱和FA 如硬脂酸、棕榈酸去饱和化变成不饱和的亚油酸和棕榈油酸，亚油酸和棕榈油酸则在长链脂肪酸延长酶（long-chain fatty-acyl elongase，ELOVL）的作用下，转化为其它不饱和酸而为细胞存活提供支持[35-36]。而硬脂酸、棕榈酸去饱和化受阻可能导致FA 堆积和不平衡[35,37-38]，诱导内源性细胞凋亡。综上所述，我们发现制何首乌醇提物通过抑制SREBP1的转录活性而降低肝癌细胞的脂代谢，诱导了细胞内源性凋亡[39]。但制何首乌醇提物中何种成分发挥了作用，不得而知。

3 何首乌抗肿瘤脂代谢的物质基础

我们在前期文献复习中，发现何首乌主要的抗癌活性成分包括二苯乙烯类成分如二苯乙烯苷（2,3,5,4-tetrahydroxy-stilbene-2-O-β-D-glucoside，TSG）和白藜芦醇（resveratrol）；蒽醌类成分如大黄素（1,3,8-trihydroxy-6-methyl-anthraquinone，emodin），芦荟大黄素（aloe-emodin），大黄酚（chrysophanol），大黄素甲醚（physcion），大黄酸（rhein），大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷（emodin-8-O-β-D-glucoside），大黄素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷（physcion-8-O-β-D- glucoside），鞣质类（tannins）等[6,11]。TSG 在何首乌中含量很高，但其抗肿瘤作用报道不多，顾民华等[40]报道它能增加肝癌细胞对顺铂的敏感性，我们在前期实验中发现，TSG对肿瘤细胞增殖抑制浓度大于1 000 μM（数据未发表）时单独抗肿瘤作用研究价值不大。而大黄素等蒽醌类化合物抗癌活性报道较多[30]，文献报道何首乌中有蒽醌类成分22 种[41-42]。我们选取了6 种常见的化合物：大黄素、大黄酸、芦荟大黄素、大黄素甲醚和大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黄酚，进行抗肿瘤脂代谢的筛选。以MTT 法检测了6 种蒽醌类化合物对肝癌细胞Bel-7402 的增殖，并检测了对SREBP1 的mRNA 和蛋白的表达影响，结果发现这6 种蒽醌类成分对肝癌细胞的抑制作用顺序大小依次为：大黄素、大黄酸、芦荟大黄素、大黄素甲醚和大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黄酚。其中IC50值小于400 μM 的有大黄素、大黄酸、芦荟大黄素和大黄素甲醚；对SREBP1 的mRNA 和蛋白表达有抑制作用的是大黄素、大黄酸和大黄素甲醚[43]。大黄酚对肝癌细胞SREBP1 无抑制作用，这与Li 等人报道的大黄酚可通过抑制SREBPs 表达抑制肝癌细胞Huh-7 脂代谢的结果不一致[32]，这可能是因为细胞系的不同以及实验室间差异。由于大黄素在何首乌蒽醌类成分中含量最高[44]，且Lee 等人报道它对肿瘤细胞的FA 合成有抑制作用[31]，因此，我们选用大黄素为代表，研究何首乌抗肿瘤脂代谢的主要活性及其作用机制。

大黄素，除何首乌外，还存在于其它蓼科植物如大黄、虎杖和豆科决明子等植物中[16]。它能抑制肿瘤细胞周期因子D（Cyclin D）和细胞周期因子E（Cyclin E）[45]，周期蛋白依赖性激酶2（cyclin-dependent kinases 2，CDK2）[46]；通过激活胞外凋亡因子fas 配体（Fas ligand，FASL）[47]、细胞色素C（cytochrome C）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9（cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase-9）和凋亡诱导因子（apoptosis-inducing factor，AIF）[48]，降低细胞膜电位（membrance potential）[49]而诱导细胞凋亡[50]；通过抑制转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）以 及Wnt/β-Catenin 通路抑制迁移和侵袭；通过抑制多药耐药相关蛋白（multidrug resistance-associated protein 1，MRP-1）而逆转肿瘤多药耐药[51]；通过抑制FA 合成而抑制肿瘤脂代谢[31]。此外，大黄素还可以同时诱导肿瘤细胞内源性凋亡和外源性凋亡[52]。因此，我们首先检测了大黄素对肝癌细胞凋亡的影响，发现它能够降低细胞的膜电位，诱导Caspase 依赖的和非依赖的内源性细胞凋亡。通过检测TG和总胆固醇（total cholesterol，TC），以及亚油酸/硬脂酸、棕榈油酸/棕榈酸的比例，发现大黄素可以使TG、TC 合成减少，并减少了硬脂酸和棕榈酸的去饱和化，同时qPCR 和蛋白印迹实验发现大黄素使肝癌细胞的脂肪酸合成酶ACLY、ACACA、FASN以及SCD1表达减少，同时SREBP1也受到抑制。此结果与上述制何首乌醇提物对肝癌细胞的抑制机制近似，提示制何首乌醇提物中主要降脂抗癌活性物质有大黄素。为进一步验证SREBP1在大黄素抗肿瘤脂代谢中的作用，我们又建立了SREBP1 过表达（SREBP1-OE）和敲除（SREBP1-KO）细胞株，与大黄素作用进行对照，发现有趣的是，大黄素对肿瘤细胞的凋亡作用和对脂代谢的抑制作用虽然与SREBP1敲除的结果类似，但大黄素的凋亡诱导作用强度远远大于SREBP1敲除的结果。提示大黄素是通过SREBP1依赖和非依赖的途径诱导了内源性凋亡[53]。结合Lee 等人有关大黄素可抑制FASN 的报道[31]，我们推测大黄素可能同时激活了内源性和外源性凋亡途径，其中内源性凋亡途径与抑制脂代谢有关。此外，制何首乌醇提物及大黄素不仅仅通过抑制SREBP1 而诱导凋亡，或者换言之，单纯敲除SREBP1并不能使肿瘤细胞过度凋亡，提示肿瘤细胞的脂代谢只是能量代谢、生存的一种途径而不是主要途径[54-56]。这一结果从肿瘤的耐药和难治性考虑有一定的意义。一方面，单纯抑制肿瘤的SREBP1 途径只能控制细胞增殖而不能完全杀灭肿瘤细胞，可能导致耐药；另一方面，目前有些化疗病人无法耐受甚至死于化疗不当[57]，远不及带瘤生存、提高病人生存质量收益更大。

4 展望与结语

早期研究证实，肿瘤细胞及组织中FA、磷脂（phospholipid）高于正常组织，FA 的合成异常升高，这与脂质合成的FASN 调控密切相关[3]。FASN 抑制剂在HER2/neu 转基因小鼠中被证实有效[58-60]。脂质合成其他酶包括ACACA、SCD1[60-62]等，受到抑制后也可影响肿瘤细胞的生长、增殖。作为第二信使的磷酸肌醇（inositol phosphate）、溶血磷脂酸（lysobisphosphatidic acids，LPA）等，通过激活下游信号蛋白增强肿瘤细胞的增殖、迁移和存活[63]。近年来研究还表明作为脂质合成的关键转录因子SREBP1异常表达与肿瘤的恶性程度密切相关[64-66]，提示SREBP1是中药抗肿瘤脂代谢的重要靶点。

肿瘤防治是个复杂的问题，中医药在防治肿瘤上发挥着一定的作用。以何首乌为例，我们发现它有抑制肿瘤的脂代谢的作用，机制与抑制SREBP1 通路有关。但同时，它还有SREBP1 非依赖性的诱导凋亡通路。由于何首乌中成分复杂，抗肿瘤活性成分以蒽醌类为主，但蒽醌类成分作用强弱却不一样，，提示中药抗肿瘤存在多成分、多靶点、多途径。展望下一步工作，一是包括抑制脂代谢在内的何首乌抑制肿瘤作用与机制到底如何，需要进一步研究；二是活性成分对脂代谢SREBP1 的作用有强有弱、有的甚至没有。我们在对6 种常见的化合物大黄素、大黄酸、芦荟大黄素、大黄素甲醚和大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黄酚，进行抗肝癌Bel-7402 细胞脂代谢的筛选中，发现48h内IC50值小于400 μM 的有大黄素、大黄酸、芦荟大黄素和大黄素甲醚。其中小于或等于100 μM 有大黄素和大黄酸[42]。而我们用制何首乌醇提物（对人肝癌Bel-7402 细胞24 h 的IC50值约400 μg/mL）中游离蒽醌类含量（以大黄素和大黄素甲醚计）为0.1%[38]，若全部以大黄素计，制何首乌醇提物中大黄素（分子量270.24）折合成摩尔浓度为：1.48 μM，远远小于大黄素的IC50值。但制何首乌醇提物与单纯的活性成分大黄素作用强弱相似，是实验误差问题，还是成分之间的相互作用?有些成分即使没有作用，但是否有促进其它成分活性的可能性?是增强作用（potentiation），还是中药多组分的叠加作用（additive effect of multiple compounds of TCMs）[67]?此外，我们前期总结发现蒽醌类成分也存在于其它植物如大黄、决明、虎杖等。其含量也不尽相同，其中大黄素在何首乌中含量为0～1.52%，比其它植物相对高[23]，结合何首乌及其活性成分对肝癌脂代谢的影响各异，深入研究何首乌中蒽醌类成分降脂抗癌活性及其成分之间相互作用，有一定意义。

研究抗肿瘤中药的另一个重要问题就是抗肿瘤中药技术方法的规范性问题。具体到何首乌抗肿瘤研究的问题，市售何首乌质量不一，生首乌和制首乌由于来源不同、产地不同，采收季节不同、炮制加工不同其质量会有不同[68-69]。因此，研究何首乌首要的工作是质量控制。此外，药理学机制研究需基于某一公认度高的靶点或机制分类方法，并以此建立技术平台[2]。何首乌的抗肿瘤机制研究正是我们建立了基于肿瘤生物学特征的筛选平台，从肿瘤的细胞能量代谢失衡入手，发现了其抑制脂代谢的机制（Fig 1）。

Fig 1 针对肿瘤生物学特征的何首乌抗脂代谢研究思路与技术路线。实线为本课题组研究发现。虚线为可能存在的其它途径。