周海岩，李会帅，王 培，柳志强

（1．浙江省生物有机合成技术研究重点实验室，生物工程学院，浙江工业大学，浙江 杭州310014；2．生物转化与生物净化教育部工程研究中心，浙江 杭州310014）

反式－4－羟基－L－脯氨酸（4－Hyp）是一种应用广泛的高附加值非天然氨基酸［1］。在化工领域4－Hyp可作为手性原料合成多种聚合物［2］。在动物饲料应用上，添加4－Hyp可防止因甘氨酸合成不足而导致的营养不良现象的发生［3］；在医药领域，可作为原料用于合成碳青霉烯类抗生素［4］。此外，4－Hyp还具有消除氧化剂和调整细胞的氧化还原状态的潜在效果［5］，因此许多高级化妆品中都添加有4－Hyp，以期延缓衰老［6－7］。4－Hyp市场需求呈现逐年递增的趋势，目前国内市场售价超过60万元／t。4－Hyp的制备方法主要有蛋白水解法、生物催化和发酵法。蛋白水解法［8－10］是目前4－Hyp的主要制备方法，但其路线长（保护／去保护）、环境污染严重、成本高，得率只有4%～7%。因此，绿色、高效、低成本的4－Hyp的生物合成技术的开发具有广阔的发展前景［11］。4－Hyp的生物合成方法包括生物催化和发酵法［12］，其中高活性L－脯氨酸－4－羟化酶（P4H）的挖掘和开发是生物法合成4－Hyp能否成功的决定性因素。P4H 属于 Fe2＋／α－酮戊二酸（α－KG）依赖型双加氧酶，一般存在于细菌中，可在Fe2＋，α－KG存在的条件下将游离的L－脯氨酸4－位羟基化［13］。Shibasaki等通过高效筛选首次从微生物指孢囊菌RH1中获得了P4H，然后将该基因进行克隆和异源表达，构建了表达P4H的重组大肠杆菌，该菌株在含有底物L－脯氨酸的发酵培养基中进行培养，100h后可积累41g／L 4－Hyp［14－15］。为了降低4－Hyp的生产成本，Shibasaki等在4－Hyp生产中过表达L－脯氨酸合成的关键酶基因，以葡萄糖为碳源发酵96h后，4－Hyp产量达到了25g／L［16］。……