吴晓峰

（青海省心脑血管病专科医院 心内科，青海 西宁 810000）

目前，冠状动脉（以下简称冠脉）疾病患者在介入治疗时常伴有心律失常等不良反应。其中，心房颤动（atrial fibrillation, AF）是最常见的持续性心律失常，普通人群患病率为1%～2%[1-2]。AF患者的卒中风险较正常人群增加5倍，AF引起的缺血性卒中可能致命[3-6]。本研究将冠脉介入治疗后发生/未发生AF患者各4例进行转录组测序，分析这些样本差异表达的枢纽基因与临床表型（如AF等）之间的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2016年5月—2017年5月青海省心脑血管病专科医院收治的AF患者14例作为AF组，选取同期医院收治的冠脉介入治疗后未发生AF患者14例作为非AF组。两组各4例患者的左心房组织用于转录组测序，各10例患者的左心房组织用于基因表达的验证实验。在转录测序患者中，房颤组男性3例，女性1例；平均年龄（62.5±3.7）岁；高血压3例；非房颤组男性2例，女性2例；平均年龄（59.2±3.9）岁；高血压1例。AF组与非AF组患者的一般资料比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。本研究经医院伦理委员会的审批同意，患者均在知情同意书上签字。

1.2 方法

1.2.1 高通量测序 深圳华大基因生物信息科技有限公司通过HiSeq 2000测序仪（美国Illumina公司）完成了本研究的转录组测序（RNA sequencing, RNASeq）工作。

1.2.2 测序数据的前处理 利用TopHat v2.01软件，比较参考基因和测序数据，通常状况下序列的比对率要求＞90%[7]。以每百万读段的碱基片段（fragments per kilo bases per million reads, FPKM）评估基因表达的水平[8]。

1.2.3 差异基因表达分析 首先将冠脉介入治疗后两组患者左心房组织的基因表达水平进行比较，应用Cufflinks v2.2.1软件挖掘出错误发现率（the false discovery rate, FDR）＜0.05的差异表达基因，每个差异表达基因经校正后的显著性=差异基因的P值×基因总数/最大P值对应的排序号[9]。

1.2.4 加权基因共表达网络（weighted gene co-expression network, WGCN）分析 运用WGCN来分析差异表达基因[10]。本研究提到的共表达网络的定义为：1个基因由1个节点代表，在相同的基因网络中，不同样本有共性表达，通过其相关表达系数来衡量基因之间的共表达关系。①WGCN的建立：连接相关基因时，选择权重的标准为p（i）～i-r，即连接数为i的概率p（i）与i的n次方成反比，并且服从无尺度网络分布。对加权系数进行选择，进而实现应用过程中无尺度网络分布。同时满足以下条件：如果模块不同，其中的基因平均连接度就高，这个节点产生概率的对数值[log p（i）]和连接点个数的对数值[log（i）]呈负相关。②WGCN构建的方法：幂指数邻接函数被应用于WGCN算法。应用邻接系数αmn这个指标可以衡量任何基因对的相关性，也就是针对相关系数进行次方的幂指数加权：αmn=power（Smnβ）=|Smn|β。确定加权系数β要严格遵守无尺度网络原则，指连接节点个数取对数[log（k）]与节点出现的概率的对数值[log p（k）]之间相关系数与0.8非常接近。把邻接函数参数β确定好以后，随后转换相关矩阵S=|Smn|。③基因集模块与表型信息的关联：计算得到基因模块特征值，再计算模块的特征向量与关注表型的相关系数；对于分组表型数据（如疾病状态等），可以首先定义用t-test计算每个基因在不同组（如疾病组和正常组）间基因比较有差异的P值，并将P值以10为底的对数值定义为基因显著性，再将模块内所有基因显著性值取平均数，该数值即为模块的显著性（module significant，MS）。MS值越高说明这个模块与疾病之间的关联越高。④基因的显著性也可以定义为某个基因表达谱与表型信息的相关性。

1.3 qRT-PCR检测枢纽基因的表达

用Trizol试剂裂解组织，提取总mRNA，使用日本TOYOBO公司的逆转录试剂盒，按说明书操作，逆转录得到cDNA后，进行qRT-PCR扩增检测，ABI7300设置条件为：95℃预变性3 min，95℃变性2 s，60℃延伸30 s，反应40个循环后扩增终止。

1.4 统计学方法

数据分析采用R 2.39统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较用t检验，相关分析用Pearson法，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者差异表达基因分布

两组患者左心房组织的比较中展示了差异表达基因FPKM层次聚类图的分布情况，聚类方式选用欧氏距离法（见图1）。本研究一共识别了824个差异表达基因，其中上调基因314个，下调基因510个。

2.2 基因模块的识别

通过动态剪切树法，本研究将824个差异表达基因用于WGCN分析，共识别18个基因模块。对每个基因模块的特征向量基因相似度进行分析，最终得到了8个相似度较高的模块（见图2）。

图1 两组患者差异表达基因分布

图2 基因模块的识别

2.3 各基因模块与临床表型的相关性

紫色模块与AF严重程度具有相关性（r=0.990，P=0.005）。见图 3。

2.4 枢纽基因与AF严重程度的相关性

RCAN1和DNAJA4基因在紫色模块中对AF的作用最强（均q=0.038）。见附表。

2.5 两组患者RCAN1和DNAJA4基因相对表达量比较

AF组RCAN1基因相对表达量为（9.213±2.132），非AF组为（4.891±2.215），经t检验，差异有统计学意义（t=28.756，P=0.000），AF组高于未AF组。AF组DNAJA4基因相对表达量为（0.983±0.321），非 AF 组为（5.263±0.538），经t检验，差异有统计学意义（t=30.756，P=0.000），AF组低于未AF组。见图4。

图3 各基因模块与临床信息的相关性

附表 枢纽基因与AF严重程度的相关性参数

图4 两组患者RCAN1和DNAJA4基因表达量比较（n =4，±s）

3 讨论

随着高通量技术的快速发展及其在复杂性疾病研究中的广泛应用，为研究疾病的发病机制奠定了基础[11-14]。本研究对10例冠脉介入治疗后发生AF患者以及10例冠脉介入治疗后未发生AF患者的左心房组织进行RNA-Seq测序，并根据差异基因表达谱鉴定出与临床表型相关的基因集模块，发现两个枢纽基因（RCAN1和DNAJA4）的表达变化与AF严重程度显著相关。

之前有研究表明钙调神经磷酸酶是一种细胞质Ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白磷酸酶，通过与NFAT和L型Ca2+通道的相互作用刺激心脏肥大[15-16]。已知RCAN1可抑制钙调神经磷酸酶及其相关途径[17]。但有学者表明，当高度表达并且因此增强肥大信号传导时，RCAN1可以替代地用作钙调神经磷酸酶激活剂[18]。因此，RCAN1水平的摄动（归因于遗传变异或突变）可能导致功能异常转换，从而触发心房重构和心律失常发生。DNAJA4调节KCNH2钾通道的运输和成熟，其在心脏复极化中具有重要作用，且涉及长QT综合征[19]。FHL2与许多细胞组分相互作用，包括肌动蛋白细胞骨架，转录机制和离子通道[20]。FHL2显示增强异丙肾上腺素的肥大作用，表明FHL2可能调节环境应激对心肌细胞生长的影响。FHL2还与心脏中的几种钾通道如KCNQ1、KCNE1和KCNA5相互作用[21]。此外，血管心外膜物质（blood vessel epicardial substance, BVES）和其家族其他成员被证明在心脏起搏细胞中高度表达。BVES敲除小鼠显示窦性结节功能障碍，表明BVES调节心脏起搏和传导系统的发展，因此可能参与AF的早期发展阶段[22]。

本研究的几个缺陷：首先，没有足够大的人类左心房mRNA数据集存在。因此，本研究使用独立的数据集通过PCR方法验证RNA-Seq分析的结果，结果表明本研究识别的枢纽基因是可靠的。其次，缺少基因功能性试验，在后续的研究将深入探究该枢纽基因的功能验证。

总之，本研究运用了新技术RNA-Seq对有无AF发生的左心房组织的差异表达基因进行了WGCN分析，初步定位出冠脉介入治疗后与AF有关的枢纽基因为RCAN1和DNAJA4。后续将对上述基因实施体内外功能验证，进一步阐明冠脉介入治疗后与AF发生的机制并制定防治手段。