辛燕花，张铁丹，张建华，王菲，连广平

(1.忻州师范学院生物系，山西 忻州 034000；2.广州万物生健康产业有限公司，广东 广州 )

香菇(Lentinulaedodes)是一种著名的药食同源的食用菌，它不仅是我国的一种特产还是世界第二大食用菌。它被称为民间的“山珍之王”且有“菇中皇后”之美誉。然而，一个不容忽视的问题是香菇是食用菌中含甲醛的典型代表，香菇中的甲醛主要是香菇在生长发育过程中逐步形成的，是香菇特有的正常生理代谢产物[1]。近年来，大量的研究者对香菇中内源性甲醛的形成机制进行了研究，并且取得了一定的研究进展[2～5]。然而，针对香菇中甲醛的降解机制的研究报道较少。为了防止甲醛造成生物体的致死以及突变，生物体建立了多种修复机制，使之能在含甲醛的环境中更好地生存，其中谷胱甘肽(GSH)依赖型的甲醛氧化途径就是微生物中广泛存在的一条解毒途径[6]。作用于这条途径的关键酶为甲醛脱氢酶(formaldehyde dehydrogenase，FADH)，是脱氢酶家族中的一员，存在于大多数原核及所有的真核生物中，对生物体内甲醛解毒具有重要作用[7]。目前针对香菇甲醛脱氢酶的研究比较有限，有研究者对香菇中的甲醛脱氢酶进行了克隆(GenBank GAW01839.1)，同源序列比较发现与荧光小菇中甲醛脱氢酶有91%的相似性，针对香菇甲醛脱氢酶对香菇中甲醛的含量的影响研究还未见任何报道。

本研究以香农8号作为试验菌株，通过研究不同的栽培条件下香菇不同生长阶段甲醛脱氢酶酶活和甲醛含量的变化，并进一步通过在香菇液体培养基中添加甲醛脱氢酶来探讨该酶对香菇甲醛含量的影响，为研究甲醛降解酶的生物学功能提供理论和数据支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

香菇菌种：香农8号菌种，购于福建食用菌研究所。

主要试剂：甲醛标准品，上海生工试剂公司；其他试剂均为分析纯。

培养基：香菇袋栽培养基：培养料一：木屑50%、麦麸10%、豆饼粉2%、糖0.5%、含水量65%；培养料二：甘蔗渣50%、米糠12.5%、石膏1.5%、尿素0.3%、磷酸二氢钾0.3%；培养料三：玉米芯50%、木屑20%、麦麸18%、石膏1.5%、含水量65%。PDB液体培养基：新鲜马铃薯200 g，煮沸30 min，用纱布过滤，冷却后加入葡萄糖20 g，KH2PO43 g，MgSO4·7H2O 1.5 g，加蒸馏水定容至1 L。121 ℃灭菌20 min，冷却备用。

1.2 仪器设备

B-CJ-2FCS型超净台：佳宝净化工程设备有限公司(苏州)；SHA-CA型恒温摇床：远华机械设备有限公司(河北)；HH-6型数显恒温水浴锅：鄄城创新仪器有限公司(山东)；TG16 WS型低速离心机：湘智离心机仪器有限公司(长沙)；WYC-52T型电热鼓风干燥箱：喆图科学仪器有限公司(上海)；YXQ-LS-100 A型立式压力蒸汽灭菌器：禾普生物科技有限公司(西安)；UV-5100型紫外可见分光光度计：元析仪器有限公司(上海)；KQ5200DV数控超声波清洗器：江东精密仪器有限公司(苏州)。

1.3 香菇不同生长阶段甲醛含量与甲醛脱氢酶的关系

1.3.1 香菇栽培

将上述3种香菇袋栽培养基按配方称料拌匀。分别装入 17 cm× 40 cm×0.05 cm 规格聚丙烯袋中，121 ℃灭菌60 min，冷却后接种香菇菌种，每个处理各重复3次，菌丝发满菌棒后以塑料大棚式栽培，按常规出菇管理模式管理。

取样方法：菌丝取样(菌丝发满半袋、发满全袋、转色期采样)，每次随机采样进行3次重复。菌柄和菌盖取样：各潮次子实体取样品进行甲醛检测。

1.3.2 甲醛脱氢酶酶活的测定

香菇甲醛脱氢酶的酶活测定参考文献[8]进行。

1.3.3 甲醛的测定

对香菇不同生长阶段的甲醛含量进行测定，甲醛的测定参考文献[9]进行。以甲醛标准溶液为纵坐标，吸光度为横坐标，绘制标准曲线，y=0.015 4x-0.000 7，R2=0.999 4。

1.4 不同来源的甲醛脱氢酶对香菇菌丝体甲醛含量的影响

1.4.1 甲醛脱氢酶的诱导

在PDA液体培养基中接种等量的香菇菌种后，分别加入甲醛，使甲醛的终浓度依次为：0、0.006‰、0.012‰、0.060‰、0.12‰，以不添加甲醛为对照，在恒温摇床中28 ℃，100 r·min-1培养8天，收集菌丝体，并测定甲醛脱氢酶的酶活，选取最佳的甲醛诱导体系。

1.4.2 甲醛脱氢酶的分离纯化

对经过甲醛诱导的香菇菌丝体以及配方一栽培下的新鲜香菇子实体中的甲醛脱氢酶进行初分离纯化，参照文献进行[8]。

粗酶液制备:取适量的香菇液体培养基，过滤得到菌丝球，于研钵加入菌丝球、石英砂、0.02 mol·L-1pH为8.0 的Tris-HCl 缓冲液(比例为1∶1∶2)，冰浴研磨 5 min后，置于高速离心机中4 ℃、10 000 r·min-1条件下离心10 min，取上清液，即为 FADH 的粗酶液。称取新鲜的香菇子实体0.1 g，按照上述方法制备粗酶液。

硫酸铵沉淀: 取上述粗酶液，加入硫酸铵至终浓度为 30%，搅拌 30 min后置于高速离心机中4 ℃、10 000 r·min-1条件下离心10 min，取上清液，并加入硫酸铵至终浓度为 80%，搅拌 30 min后置于高速离心机中4 ℃、10 000 r·min-1条件下离心10 min。沉淀溶于0.02 mol·L-1、pH 8.0的Tris-HCl 缓冲液，即得复溶液。

透析: 将上述复溶液装入透析袋中(体积占2/3)，用0.02 mol·L-1、 pH 8.0的Tris-HCl透析 2 h，回收透析袋中的复溶液，即为 FADH 的初酶液，并将其保存于4 ℃冰箱待用(经甲醛诱导后所得的FADH初酶液记为FADH1，经香菇子实体所得的初酶液记为FADH2)。

1.4.3 菌丝体的培养

在香菇液体培养基中接种等量的香菇菌种后，加入经甲醛诱导后香菇发酵所产的甲醛脱氢酶FADH1和香菇自身子实体分离得到的FADH2，在恒温摇床中28 ℃，100 r·min-1培养8 d，收集菌丝体，测定香菇菌丝体中的甲醛含量。

2 结果与分析

2.1 香菇不同生长阶段甲醛的含量变化

对不同栽培料培养下的香菇各个生长阶段及不同部位的甲醛含量进行测定，结果如图1。从图1可以看出，不同的培养料栽培的香菇在不同的生长阶段及不同的部位甲醛的含量有明显的差异。其中，培养料一和培养料二栽培下的香菇在菌丝体生长阶段甲醛的含量要远远高于子实体生长阶段，并且在形成子实体后，香菇菌盖中甲醛的含量要明显低于菌柄中的甲醛含量，说明在这两种培养料下香菇中甲醛含量的随着香菇的生长发育成熟，甲醛的含量逐渐的降低。而培养料三栽培的香菇在菌丝体生长的阶段甲醛的含量明显低于子实体生长阶段，比较形成子实体后香菇菌柄和菌盖中甲醛的含量发现，菌盖中甲醛的含量明显高于菌柄中甲醛的含量，说明在培养料三栽培下的香菇随着香菇的生长发育成熟，甲醛的含量逐渐升高。

图1 不同培养料栽培下的香菇甲醛含量Fig.1 The effect of different cultivation medium on the content of formaldehyde in Letinous Edodes

2.2 香菇不同生长阶段甲醛脱氢酶的酶活变化

对不同培养料栽培的香菇各个生长阶段的甲醛脱氢酶酶活进行测定，结果如图2。从图2可以看出，不同培养料栽培的香菇在不同的生长阶段甲醛脱氢酶的酶活不同。其中，培养料一和二栽培的香菇在菌丝体生长阶段检测到甲醛脱氢酶的酶活明显低于子实体生长阶段，并且发现香菇在子实体生长阶段菌柄中的甲醛脱氢酶的酶活明显低于菌盖，说明随着香菇的生长发育，香菇中甲醛脱氢酶的酶活一直在上升，这一结果正好与上述香菇(培养料一、二)中甲醛含量随着香菇的生长发育不断降低相吻合。培养料三栽培的香菇在菌丝体生长阶段检测到甲醛脱氢酶的酶活明显高于子实体生长阶段，并且发现香菇在子实体生长阶段菌柄中的甲醛脱氢酶的酶活明显高于菌盖，说明随着香菇的生长发育，香菇中甲醛脱氢酶的酶活一直在降低，这一结果同样与上述香菇(培养料三)中甲醛含量随着香菇的生长发育不断升高相吻合。综合上述结果，我们发现香菇中甲醛的含量与甲醛脱氢酶的酶活有一定的关系。

图2 不同培养料栽培下香菇FADH的酶活Fig.2 The effect of different cultivation medium on the formaldehyde dehydrogenase activity of Letinous Edodes

2.3 不同来源的甲醛脱氢酶对香菇菌丝体中甲醛含量的影响

2.3.1 添加经甲醛诱导后的甲醛脱氢酶对香菇菌丝体中甲醛含量的影响

通过测定在香菇液体培养基中添加不同浓度的甲醛诱导香菇产甲醛脱氢酶的酶活发现，不同浓度的甲醛含量对香菇菌丝体产甲醛脱氢酶有一定的影响(图3)。从图3中可以看出，与对照相比，在香菇菌丝体中添加一定量的甲醛可以诱导香菇菌丝体产甲醛脱氢酶，并且在添加外源甲醛的浓度为0.006‰时，香菇菌丝体中产甲醛脱氢酶的酶活达到最大值0.68 U·g-1。

图3 不同浓度的甲醛对香菇甲醛脱氢酶的影响Fig.3 The effect of different concentration of formaldehyde on the formaldehyde dehydrogenase activity of Letinous Edodes

对添加甲醛浓度为0.006‰的香菇液体培养基中的甲醛脱氢酶进行分离纯化后得到甲醛脱氢酶的初酶液。在香菇液体培养基中添加不同体积的初酶液(0.5、1.0、1.5、2.0 mL)，以不添加初酶液的香菇液体培养基为对照，进行培养后，测定香菇菌丝体中甲醛的含量，结果如图4所示。从图中可以看出，香菇菌丝体中甲醛的含量随着添加甲醛脱氢酶的浓度增加明显下降，说明甲醛脱氢酶可以有效的降低香菇中甲醛的含量。

图4 不同浓度的甲醛脱氢酶1对香菇中甲醛含量的影响Fig.4 The effect of different concentration of formaldehyde dehydrogenase 1 on formaldehyde of Letinous Edodes.

2.3.2 添加香菇子实体中甲醛脱氢酶对香菇菌丝体中甲醛含量的影响

将提取新鲜香菇子实体中的甲醛脱氢酶的初酶液按照不同的浓度添加到香菇的液体培养基中进行培养后，测定香菇菌丝体中甲醛的含量，结果如图5所示。从图中可以看出，与对照相比，香菇菌丝体中甲醛的含量随着添加甲醛脱氢酶的浓度增加明显下降，甲醛脱氢酶显著的降低了香菇菌丝体中甲醛的含量。

图5 不同浓度的甲醛脱氢酶2对香菇中甲醛含量的影响Fig.5 The effect of different concentration of formaldehyde dehydrogenase 2 on formaldehyde of Letinous Edodes.

3 讨论

香菇中甲醛的形成规律受环境因素的影响较明显，在本研究中，采用了三种不同的培养料栽培香菇，其中培养料一和培养料二栽培下的香菇中甲醛的含量随着香菇的生长发育成熟逐渐下降；培养料三栽培下的香菇中甲醛的含量随着香菇的生长发育成熟逐渐递增，多数研究结果表明香菇在菌丝培养阶段甲醛的含量较低(1.46～29.9 mg·kg-1)，随着原基形成至子实体成熟，菇体中甲醛含量呈递增(6.51～20.45 mg·kg-1)[2～4,10]，而本研究中所采用的培养料一栽培下的香菇在子实体阶段甲醛含量明显低于菌丝体阶段，更合适用来栽培香菇。

甲醛脱氢酶作为甲醛氧化途径的一个关键酶，对生物体中的甲醛解毒起着关键的作用。在本研究中，不同培养料栽培的香菇在不同的生长阶段甲醛含量不同，甲醛脱氢酶的酶活性也呈现出一定的变化。比较在同一培养料栽培下，甲醛脱氢酶的酶活越高高，甲醛含量越低；在不同培养料栽培下的香菇，同样表现出甲醛脱氢酶的酶活越高，甲醛含量越低的现象。为了进一步验证甲醛脱氢酶对香菇中甲醛的氧化作用，通过在香菇液体培养基中添加甲醛脱氢酶来检测香菇中甲醛的含量。

本研究中的香农8号在PDB液体的基础上，添加了以甲醛作为碳源的培养基进行诱导培养，对产生的甲醛脱氢酶的酶活进行检测后发现，添加一定浓度甲醛的培养基中香菇菌丝体产FADH的酶活要显著高于对照，说明香菇在外源甲醛的诱导下，体内甲醛氧化途径中的甲醛脱氢酶能够进行高效表达，产生应激反应，代谢香菇体内的甲醛。因此，通过优化香菇发酵条件，提高香菇产甲醛脱氢酶的酶活，来降低香菇体内的甲醛是行之有效的方法。其次，对添加了经甲醛诱导后产生的FADH及香菇子实体自身的FADH后，发现这两种来源的酶都能可以有效的降低香菇体内的甲醛。在后续的实验中将进一步对这两种来源的酶进行分离纯化，得到纯品，探讨二者结构的相似与差异，研究其酶学性质，为探讨香菇中甲醛含量提供一定的理论依据。