董爱爱 郭继龙 崔依依 冀雨芳 李上庆 刘高峰 来晓云 董 琦 冀来喜△

（1.天津中医药大学，天津 300193；2.山西中医药大学，山西 太原 030600；3.山东省淄博市张店区中医院，山东 淄博 255035；4.山西省中医药研究院，山西 030012）

原发性高血压（EH）是脑血管疾病的高危因素，自发性高血压大鼠（SHR）模型因可高度模拟人高血压的形成及发展过程，且适于降压方案的筛选，一直是众多学者关注的热点。EH病理进展及其所致的心脑肾靶器官受损与高 RAS 活性［1］和高交感神经兴奋性［2］密切相关。经典的RAS主要由肾素原（AGT）、肾素、ACE、血管紧张素Ⅰ（AngⅠ）、血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）及其相应的受体组成。循环中的AGT在肾素的作用下转变成AngⅠ，AngⅠ在ACE的作用下水解为AngⅡ，后者进而水解为AngⅢ，但因AngⅠ、AngⅢ的代谢清除率较高，因此在 RAS 中仍是 AngⅡ起主要作用［3］。AT1 受体（AT1R）介导的生物学效应较AT2受体强，其可收缩血管、刺激醛固酮释放，进而改变血压、影响水/电解质平衡［4］。外周RAS受中枢调控，中枢RAS系统活性与交感神经活动联系密切［5］，中枢交感输出的最终共同通路［6］在延髓头端腹外侧区（RVLM）区，且该区活动受到GABA的调节［7］。基于此及既往课题组针穴降压研究［8］基础，本研究讨论针刺对 SHR延髓、肾脏 AngⅡ、AT1R及交感枢纽RVLM区GABA的影响。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选用16周雄性Wistar大鼠15只，体质量250～290 g。 SHR大鼠 30只，体质量 280～310 g，北京维通利华实验动物技术有限公司提供，许可证号：SCXK（京）2009-17。饲养于山西中医药大学 SPF级动物实验室。

1.2 试药与仪器 BP-600A全自动大小鼠无创血压测量系统，成都泰盟软件有限公司产品；Bio-RAD 680酶标仪，美国伯乐公司产品。兔多克隆抗AT1抗体（博士德ZP1974BP74）；兔多克隆抗GABA抗体（博奥森bs-2252R）；博士德山羊抗兔IgG、卵白素-生物素结合物（SABC）、二氨基联苯胺（DAB）。

1.3 动物分组 30只SHR大鼠采用随机数字表法随机分为SHR组、针刺组各15只。15只WKY大鼠设为WKY组作为对照组。

1.4 干预方法 适应性饲养1周后开始干预。针刺组取双侧人迎、曲池、足三里穴治疗，留针20 min。每日1次，每治疗 6 d，休息 1 d；疗程 8周，共治疗 48次。WKY组、SHR组和针刺组采用自制鼠板行相同时间、相同程度的捆绑固定，并于针刺治疗结束后解除固定。每日自由食水，取材前1 d禁食水。

1.5 标本采集 大鼠行水合氯醛300 mg/kg，腹腔注射麻醉。眼眶采血2 mL，离心血清备用。于左侧肾门处止血钳夹闭肾动静脉，迅速摘取左肾，将其上极肾皮质游离出来，按质量（g）∶容积（mL）＝1∶9 比例加入冰 0.9%氯化钠注射液进行匀浆，5000 r/min离心15 min取组织上清待测；将余左肾冠状切取5 mm厚，于4%多聚甲醛中4℃固定。经左心灌流0.9%氯化钠注射液150 mL，冰台操作迅速取脑，去除小脑，取Obex点以上延髓及大脑，参照Paxinos&Watson大鼠脑图谱可定位 RVLM［9］，并将固定完的脑组织置于大鼠脑模具上选择包含RVLM的延髓段（第十二对脑神经头侧第一分支前 0.6～1.0 mm，中线旁开 1.7～1.9 mm，腹侧表面下0.5～0.8 mm）。针头吸取左侧RVLM区组织，匀浆（同肾组织）备测，剩余延髓RVLM层面脑片于4%多聚甲醛中固定。组织固定36 h后，按常规制备石蜡包埋切片，连续切片厚3 μm。按各指标5张脑片留取备检。

1.6 免疫组化和图像分析 采用免疫细胞化学染色（ABC法），石蜡切片，经二甲苯、梯度（由高至低）酒精依次脱蜡至水。3%H2O2（PBS配）15min去除内源性过氧化物酶的活性，高压锅15 min热抗原修复，羊血清37℃孵育30 min以去除非特异性染色。AT1R抗体（稀释 1∶100）、GABA 抗体（稀释 1∶400），加一抗后于4℃过夜；加入二抗山羊抗兔IgG于37℃孵育30 min；再加SABC（卵白素-生物素结合物）37℃孵育30 min；最后用二氨基联苯胺（DAB，博士德）显色，苏木素复染核30 s。用非免疫兔血清IgG（1∶5）代替一抗作阴性对照，未观察到阳性表达。用Image pro plus图像软件计算AT1R、GABA免疫组化阳性表达平均光密度（MOD）。

1.7 统计学处理 应用IBM SPSS Statistics 22统计软件。计量资料以（±s）表示，各组间各指标比较采用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠收缩压及舒张压比较 见表1。SHR组大鼠血压明显高于WKY组，针刺组血压显著低于SHR 组（P＜0.05）。

表1 各组大鼠血压比较（mmHg，±s）

表1 各组大鼠血压比较（mmHg，±s）

与 WKY 组比较，*P＜0.05；与 SHR 组比较，△P＜0.05；与针刺组比较，#P＜0.05。 下同

组别 n D B P S B P W K Y 组 1 5 9 8.0 9±2 3.3 0△ 1 1 8.2 5±6.2 8△S H R 组 1 5 1 4 0.7 5±1 4.1 3*# 1 6 5.7 5±9.0 6*#针刺组 1 5 1 2 5.9 1±1 2.5 8△ 1 5 1.7 9±7.9 4△

2.2 各组大鼠血清、肾、延髓左侧RVLM区AngⅡ水平比较 见表2。SHR大鼠血清、肾和延髓左侧RVLM区匀浆AngⅡ明显高于WKY组（P＜0.05）；针刺组肾和脑组织匀浆AngⅡ显著低于SHR组（P＜0.05），而血清 AngⅡ无显著变化（P＞0.05）。

表2 各组大鼠血清、肾和延髓左侧RVLM区匀浆AngⅡ比较（pg/mL，±s）

表2 各组大鼠血清、肾和延髓左侧RVLM区匀浆AngⅡ比较（pg/mL，±s）

组 别 肾 延髓R V L M区W K Y 组 1 9 7.3 6±3 7.8 3△ 2 8 7.4 2±4 1.2 6△n 血清1 5 3 5 4.4 5±2 9.1 5△S H R 组 4 4 5.6 3±5 2.3 3*#5 2 6.1 5±6 5.8 3*#1 5 6 9 8.5 2±3 7.2 8*针刺组 1 5 6 4 2.9 4±2 9.8 3 3 3 5.2 6±4 9.5 8△ 3 9 2.4 6±4 3.6 4△

2.3 各组肾脏AT1R、延髓右侧RVLM区AT1、GABA表达 见表3，图1，图2。SHR组的肾脏、延髓右侧RVLM区AT1R分布的MOD值显著高于WKY组（P＜0.05），GABA表达结果则是前者低于后者 （P＜0.05）。与SHR组相比，针刺组AT1R表达降低，GABA表达升高（P＜0.05）。

表3 各组大鼠肾脏AT1R、延髓右侧RVLM区AT1R与GABA 比较（MOD，±s）

表3 各组大鼠肾脏AT1R、延髓右侧RVLM区AT1R与GABA 比较（MOD，±s）

?组 别 R V L M区A T 1 R R V L M区G A B A W K Y 组 0.2 1 8±0.0 3 1△ 0.3 4 9±0.0 3 6△n 肾A T 1 R 1 5 0.1 4 4 ±0.0 2 2△S H R 组 0.4 8 5±0.0 8 3*# 0.1 6 8±0.0 4 5*#1 5 0.5 9 1±0.1 8 7*#针刺组 1 5 0.3 7 9±0.0 5 7△ 0.3 4 1±0.0 4 6△ 0.2 0 2±0.0 2 8△

图1 各组大鼠肾免疫组化AT1R表达（免疫细胞化学染色ABC法，400倍）

图2 各组延髓RVLM区免疫组化AT1R及GABA表达（免疫细胞化学染色ABC法，200倍）

3 讨 论

本实验表明针刺能明显降低SHR大鼠的血压。降压效应指标比较显示，血浆AngⅡ水平远高于肾组织，这与龙海波等［10］研究结果一致。因肾脏局部依靠自分泌/旁分泌系统及脑组织血脑屏障的特殊存在，肾［11］和脑［12］的RAS活性均可独立于循环调控。肾组织中AngⅡ水平与肾小球、肾小管内皮细胞等部位AT1R的表达呈正相关，本研究亦得出SHR组肾、延髓AngⅡ水平及AT1R表达较WKY组一致性升高。

与WKY组比较，SHR组肾脏AT1R表达（MOD）显著增加，且存在肾小动脉管壁增生、肾小球基底膜皱缩、球囊间隙增宽、肾小球固缩等明显的高血压靶器官损伤病理改变。针刺治疗组肾损害减轻，肾小球固缩发生较少，球囊间隙增宽不明显。因此针刺治疗能部分缓解肾小球萎缩，AT1R阳性表达明显低于模型组，可为针刺降压及肾保护作用提供线索。肾脏局部的AngⅡ可以直接与近端肾小管AT1R相结合，导致肾脏高血压、高灌注、高滤过等损伤。有研究表明［4］AngⅡ可以促进肾小球脏层细胞肥大，使足突增宽，纤连蛋白合成增加。

本研究表明给予针刺治疗后，肾脏的AngⅡ水平低于SHR组，而对血清中的AngⅡ作用不明显；说明针刺能使肾脏AngⅡ合成减少，与AT1R结合发挥的效应被抑制。本实验未发现针刺组与模型组血清AngⅡ的差异，推测受到AT1R降低后代偿性AngⅡ升高等混杂因素影响。研究表明［13］，AT1R被阻断的情况下，机体内AngⅡ虽然会代偿性升高，但并不能发挥其生物学效应；相反，更多的AngⅡ经由Ang1-7及AT2R途径发挥降压效应。另有研究发现［3］，肾脏局部产生的AngⅡ，部分可随尿排出；但因循环中的AngⅡ亦可通过肾小球滤过膜而重吸收，因此血循环及尿中AngⅡ水平不能反映肾脏局部的RAS活性，但肾内的AngⅡ浓度与肾脏硬化呈正相关。这为本研究结果—针刺治疗降低肾组织AngⅡ水平及AT1R阳性表达并能部分缓解肾小球萎缩提供了理论基础。

针刺组较SHR组延髓RVLM区AngⅡ、AT1R降低而GABA则升高，提示SHR组GABA能神经元功能降低，对RVLM区交感活动的内源性抑制作用减弱。另外SHR组增多的AT1R，可作用于α1肾上腺素受体从而促进交感神经元兴奋，研究表明AngⅡ、AT1R与谷氨酸受体［14］密切相关，共同参与调节交感神经活性。脑组织AT1R表达在神经胶质细胞和神经元内，GABA主要由神经元内的谷氨酸经谷氨酸脱羧酶（GAD）脱羧而成［15］，主要储存于胞浆内。 AT1R 分布集中在血管、心、脑及肾中，介导AngⅡ的大部分生物学效应，引起血管收缩及靶器官损害。GABA作为抑制性神经递质可抑制升压神经元，这种紧张性抑制作用在SHR大鼠较正常血压大鼠明显减弱［16］。AT1R和GABA有共同［17］的下游通路——钙离子依赖的PKC路径来调节蛋白的磷酸化。

本实验得出，与Wistar大鼠相比，SHR大鼠的RVLM区AT1受体MOD明显较高，而同区域GABA受体MOD明显偏低，因此我们推测RVLM区细胞表面的AT1R、GABA受体密度差异可能是SHR对AngⅡ刺激反应性提高及血压升高的主要因素。研究表明［18］AngⅡ亦可影响神经递质的释放，可激活RVLM区GABA能神经元末端的AT1R，通过G蛋白偶联受体信号Gi/Go蛋白通路、NADPH-ROS氧化应激路径，抑制神经突触末端GABA的释放，降低GABA受体的活性。本研究表明针刺能部分逆转SHR大鼠RVLM区AngⅡ高水平及AT1R高表达，并调高GABA表达水平。RVLM为重要的交感神经通路核团［19］，能整合动脉压力感受器的神经传入及GABA能神经元的抑制性中转信号。

针刺降压作用确切，机制研究颇多。Ohsawa H等［20］通过针刺大鼠后肢足三里穴，观察到平均动脉压下降和肾交感神经活性下降，而切断同侧坐骨神经或股神经，该效应消失；并发现肢体传入纤维与脑干胃迷走传出节前神经元的功能联系比腹部传入纤维要强。另外一项针刺对迷走和交感神经影响的实验研究［21］表明，以麦角胺阻滞交感神经节后纤维，针刺足三里穴引起的迷走神经作用消失，说明迷走神经是“足三里”针效的必要传出途径，又必须在交感神经存在的情况下才能发生。我们认为针刺足三里穴兴奋迷走神经能拮抗交感神经作用，从而抑制交感兴奋引起的血压升高。这也是本实验针刺曲池、足三里穴降压的理论依据。针刺人迎穴可通过刺激穴下交感神经干和迷走神经，起到调整自主神经功能从而降压的作用［22］。 安娜等［23］研究亦显示针刺人迎穴可以通过影响5-HT1A等抑制交感神经活性，改变感觉信息传递，从而降压。基于上述针刺穴位的神经理论基础及本研究结果，提示针刺人迎、曲池、足三里穴可以提高RVLM区GABA的表达，降低肾组织AngⅡ、AT1R水平，抑制RAS系统及交感神经传出从而降压。